Biologische methoden voor geneesmiddelenbeoordeling

Wanneer fysische of chemische evaluatiemethoden of kwantiteit van het monster zeer minder niet in staat zijn om een ​​bevredigend resultaat in geneesmiddelen te produceren, worden de geneesmiddelen beoordeeld door biologische evaluatiemethoden. Deze methoden worden uitgevoerd op levende dieren, waarbij levend orgaan en weefsel, dierlijke preparaten en micro-organismen worden geïsoleerd. De biologische evaluatiemethoden die op het levende organisme worden uitgevoerd, worden bioassay of biologische assay genoemd.

De volgende methode wordt gebruikt als:

1. Anti-inflammatoire activiteit van medicijnen

2. Antipyretische activiteit van geneesmiddelen

3. Anti-diabetische activiteit van medicijnen

4. Pijnstillende activiteit van geneesmiddelen

5. Antiulcer-activiteit van medicijnen

6. Anthelmintic drugactiviteit: ze worden uitgevoerd op aarde-wormen

7. Hartactiviteit van het geneesmiddel: de hartglycosiden worden beoordeeld op kikker en duif

8. Microbiologische methoden: de levende bacteriën, gisten en schimmels worden gebruikt voor het testen van vitamines en om de activiteit van antibiotica te bepalen.

Ontstekingsremmende activiteit van drugs:

Paw oedeem methode:

Mannelijke of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten met een lichaamsgewicht tussen 100 en 150 g worden gebruikt. De dieren worden een nacht uitgehongerd. Om uniforme hydratatie te verzekeren, ontvangen de ratten 5 ml water via de maagslang (controles) of het testgeneesmiddel opgelost of gesuspendeerd in hetzelfde volume. Dertig minuten later worden de ratten geprikkeld door een subcutane injectie van 0, 05 ml 1% oplossing van carrageen en in de plantaire zijde van de linker achterpoot. De poot is gemarkeerd met inkt op het niveau van de laterale malleolus en ondergedompeld in kwik tot deze markering.

Het pootvolume wordt vlak na injectie plethysmografisch gemeten, opnieuw 3 en 6 uur en uiteindelijk 24 uur na de prik. De toename van het pootvolume na 3 of 6 uur wordt berekend als percentage vergeleken met het volume gemeten onmiddellijk na injectie van het irritatiemiddel voor elk dier.

Effectief behandelde dieren vertonen veel minder oedeem. Het verschil in gemiddelde waarden tussen behandelde dieren en controlegroepen wordt voor elk tijdsinterval berekend en statistisch geëvalueerd. De verschillen op de verschillende tijdsintervallen geven enkele aanwijzingen voor de duur van het ontstekingsremmende effect. Een dosis-responscurve wordt uitgevoerd voor actieve geneesmiddelen en EDso-waarden kunnen worden bepaald.

Granuloma-methode met watten:

Mannelijke Wister-ratten met een gemiddeld gewicht van 200 g worden met ether verdoofd. De achterhuid wordt geschoren en gedesinfecteerd met 70% ethanol. Een incisie wordt gemaakt in de lumbale regio. Door een stompe tang worden subcutane tunnels gevormd en een gesteriliseerde katoenen korrel wordt aan beide zijden in het scapulaire gebied geplaatst.

De pellets zijn ofwel gestandaardiseerd voor gebruik in de tandheelkunde met een gewicht van 20 mg of pellets gevormd uit ruwe katoen, die een meer uitgesproken ontsteking produceren dan gebleekt katoen. De dieren worden 7 dagen subcutaan of oraal behandeld.

Vervolgens worden de dieren opgeofferd, de pellets bereid en gedroogd totdat het gewicht constant blijft. Het netto drooggewicht, dat wil zeggen na aftrek van het gewicht van de katoenpellet, wordt bepaald. Het gemiddelde gewicht van de pellets van de controlegroep en van de testgroep wordt berekend. Het percentage verandering van het gewicht van de granuloma ten opzichte van de controlegroep van het medium wordt bepaald.

Antipyretische activiteit van het medicijn:

Konijnen van beide geslachten en van verschillende stammen met een lichaamsgewicht tussen 3 en 5 kg kunnen worden gebruikt. De dieren worden in geschikte kooien geplaatst en thermokoppels verbonden met een automatische recorder worden in het rectum gebracht. De dieren mogen zich 60 minuten aanpassen aan de kooien.

Vervolgens wordt 0, 2 ml / kg met 0, 2 μg lipopolysaccharide intraveneus in het oor van het konijn geïnjecteerd. Zestig minuten later wordt de testverbinding subcutaan of oraal toegediend. De lichaamstemperatuur wordt gedurende minstens 3 uur gecontroleerd.

Een afname van de lichaamstemperatuur gedurende ten minste 0, 5 ° C gedurende meer dan 30 minuten in vergelijking met de temperatuurwaarde vóór toediening van de testverbinding wordt als een positief effect beschouwd. Dit resultaat werd na subcutaan gebruik van 45 mg / kg fenylbutazon of 2, 5 mg / kg Indomethacine gevonden.

Antidiabetische activiteit van geneesmiddelen:

Streptozotocine-geïnduceerde diabetes:

Mannelijke Wister-ratten met een gewicht van 150-220 g gevoed met een standaarddieet worden intraveneus geïnjecteerd met 60 mg / kg streptozotocine (Calbiochem). Net als bij alloxan worden drie fasen van bloedglucosewijzigingen waargenomen. In eerste instantie is de bloedglucose verhoogd, waardoor waarden van 150-200 mg% na 3 uur worden bereikt. Zes-acht uur na streptozotocine worden de seruminsulinewaarden tot viermaal verhoogd, wat resulteert in een hypoglycemische fase die wordt gevolgd door aanhoudende hyperglycemie. De ernst en het begin van diabetische symptomen zijn afhankelijk van de dosis streptozotocine.

Na de dosis van 60 mg / kg intraveneus. Symptomen treden al na 24-48 uur op met hyperglycemie tot 800 mg%, glucosurie en ketonemie. Histologisch zijn de betacellen gedegranuleerd of zelfs necrotisch. Een steady-state wordt bereikt na 10-14 dagen, waardoor de dieren kunnen worden gebruikt voor farmacologische tests.

Door Alloxan geïnduceerde diabetes: konijnen met een gewicht van 2, 0 tot 3, 5 kg worden via de oorader toegediend met 150 mg / kg alloxanmonohydraat (5, 0 g / 100 ml, pH 4, 5) gedurende 10 minuten, waardoor 70% van de dieren hyperglykemisch en uricosurisch worden. De rest van de dieren sterft of is slechts tijdelijk hyperglykemisch.

Pijnstillende activiteit van het medicijn:

Hotplate-methode:

Groepen van 10 muizen van elk geslacht met een begingewicht van 18 tot 22 g worden voor elke dosis gebruikt. De hete plaat, die in de handel verkrijgbaar is, bestaat uit een elektrisch verwarmd oppervlak. De temperatuur wordt geregeld op 55 ° tot 56 ° C. Dit kan een koperen plaat of een verwarmd glasoppervlak zijn. De dieren worden op de hete plaat geplaatst en de tijd tot likken of springen wordt geregistreerd door een stopwatch. De latentie wordt geregistreerd vóór en na 20, 60 en 90 minuten na orale of subcutane toediening van de standaard of de testverbinding.

Tail immersion test:

Jonge vrouwelijke Wister-ratten (170-210 g lichaamsgewicht) worden gebruikt. Ze worden in individuele kooien geplaatst waardoor de staart vrij rondhangt. De dieren mogen zich 30 minuten vóór het testen aanpassen aan de kooien. Het onderste gedeelte van 5 cm van de staart is gemarkeerd. Dit deel van de staart wordt ondergedompeld in een kopje vers gevuld water van exact 55 ° C. Binnen een paar seconden reageert de rat door de staart terug te trekken. De reactietijd wordt door een stopwatch in eenheden van 0, 5 s geregistreerd. Na elke bepaling wordt de staart zorgvuldig gedroogd.

De reactietijd wordt vóór en periodiek bepaald na orale of subcutane toediening van de teststof, bijvoorbeeld na 0, 5, 1, 2, 3, 4 en 6 uur. De afsnijtijd van de onderdompeling is 15 s. De wachttijd van onbehandelde dieren ligt tussen 1 en 5, 5 s. Een wachttijd van meer dan 6 s wordt daarom als een positief antwoord beschouwd.

Heffner's tailclip-methode:

Een slagaderklem wordt toegepast op de wortel van de staart van muizen en de reactietijd wordt genoteerd. Mannelijke muizen (Charles River-stam of andere stammen) met een gewicht tussen 18 en 25 g worden gebruikt. De controlegroep bestaat uit 10 muizen. De testverbindingen worden subcutaan toegediend aan gevoede muizen of oraal aan nuchtere dieren. De testgroepen en de controlegroep bestaan ​​uit 7-10 muizen.

Het medicijn wordt 15, 30 of 60 min voorafgaande tests toegediend. Een slagaderclip wordt aangebracht op de wortel van de staart (ongeveer 1 cm van het lichaam) om pijn te veroorzaken. Het dier reageert snel op deze schadelijke stimulus door de clip of de staart bij de locatie van de clip te bijten. De tijd tussen het begin van de stimulatie en de respons wordt gemeten met een stopwatch in stappen van 1/10 seconde.

Antiulcer-activiteit :

Pylorus ligatie bij ratten (Shay Rat):

Vrouwelijke Wister-ratten met een gewicht van 150-170 g hebben 48 uur lang geen toegang tot drinkwater ad libitum. Gedurende deze tijd worden ze gehuisvest in kooien met verhoogde bodems van breed gaas om kannibalisme en coprophagie te voorkomen. Tien dieren worden gebruikt per dosis en als controles. Onder ether-anesthesie wordt een incisie in de middellijn van de buik gemaakt. De pylorus is legaat, zorg wordt uitgeoefend dat noch schade aan het bloed.

Er treedt geen toevoer of tractie op de pylorus op. Het grijpen van de maag met instrumenten moet zorgvuldig vermeden worden; anders zal ulceratie zich altijd op dergelijke punten ontwikkelen. De buikwand wordt gesloten door hechtingen. De testverbindingen worden oraal toegediend door middel van sondevoeding of subcutaan ingespoten.

De dieren worden gedurende 19 uur geplaatst in plastic cilinders met een binnendiameter van 45 mm die aan beide uiteinden worden afgesloten door draadgaas. Daarna worden de dieren opgeofferd in COZ-anesthesie. De buik wordt geopend en er wordt een ligatuur rond de slokdarm dichtbij het diafragma geplaatst.

De maag wordt verwijderd en de inhoud wordt afgetapt in een centrifugebuis. Langs de grotere kromming wordt de maag geopend en vastgezet op een kurkplaat. Het slijmvlies wordt onderzocht met een stereomicroscoop. Bij de rat vormen de bovenste twee vijfde van de maag de pens met plaveiselepitheel en bezitten weinig beschermende mechanismen tegen de corrosieve werking van maagsap.

Onder een begrenzende rand, in het klierdeel van de maag, zijn de beschermende mechanismen beter in het slijmvlies van het medium twee vijfde van de maag dan in het onderste gedeelte, waardoor het antrum wordt gevormd.

Daarom komen letsels voornamelijk voor in de pens en in het antrum. Het aantal zweren wordt genoteerd en de ernst wordt geregistreerd met de volgende scores:

. 0 = geen zweer

. 1 = oppervlakkige zweren

. 2 = diepe zweren

. 3 = perforatie.

Het volume van het maaginhoud wordt gemeten. Na centrifugatie wordt de zuurgraad bepaald door titratie met 0, 1 n NaOH.

evaluatie:

Een Ulcer-index UI wordt berekend:

UI = UN + US + UP x 10-1

ik. UN = gemiddeld aantal ulcera per dier

ii. VS = gemiddelde ernstsscore

iii. UP = percentage van dieren met zweren

Zwerenindex en zuurgraad van het maaggehalte van behandelde dieren worden vergeleken met controles. Met behulp van verschillende doses kunnen dosis-responscurven worden vastgesteld voor de vorming van maagzweren en maagzuursecretie. ID50-waarden kunnen worden berekend door middel van probiteitsanalyse, waarbij 0% overeenkomt met nee en 100% met maximale gestimuleerde maagzuuruitvoer.

Stresszweer door immobilisatiestress:

Groepen van 10 vrouwelijke Wister-ratten per dosis testgeneesmiddel en voor controles met een gewicht van 150-170 g worden gebruikt. Voedsel en water worden 24 uur vóór het experiment teruggetrokken. Na orale of subcutane toediening van de testverbinding of de placebo-oplossing worden de dieren licht geanesthetiseerd met ether.

Zowel de onderste als de onderste ledematen worden aan elkaar bevestigd en de dieren worden in draadogen gewikkeld. Ze worden 24 uur lang horizontaal op 20 ° C in het donker gesuspendeerd en uiteindelijk opgeofferd in COZ-anesthesie. De maag wordt verwijderd, gefixeerd op een kurkplaat en het aantal en de ernst van ulcera wordt geregistreerd met een stereomicroscoop met behulp van de volgende scores:

.0 = geen maagzweer

.1 = oppervlakkige zweren

.2 = diepe zweren.

.3 = perforatie

evaluatie

Een Ulcer-index UI wordt berekend:

UI = UN + US + UP x 10-1

UN - gemiddeld aantal ulcera per dier.

VS = gemiddelde ernstsscore.

UP - percentage dieren met zweren