Experimenteer op het uitvoeren van zuur-snelle kleuring van bacteriën

Experimenteer met het uitvoeren van zuurbestendige kleuring van een bacterie om erachter te komen of het zuur-snel of niet-zuur-snel is!

Doel:

De meeste bacteriën kunnen worden gekleurd, hetzij door eenvoudige basische kleuring hetzij door gramkleuring, omdat hun cellen gemakkelijk vlekken opnemen.

Sommige bacteriën bezitten echter een dikke wasachtige celwand gemaakt van lipidematerialen.

Dergelijke bacteriën zijn extreem moeilijk om te worden gekleurd, omdat gewone waterige vlekken niet gemakkelijk in hun cellen kunnen binnendringen, maar eenmaal gekleurd; het is even moeilijk om de vlek uit hun cellen te verwijderen, zelfs met krachtig gebruik van zuur-alcohol als ontkleuringsmiddel. Deze bacteriën worden gekleurd door zuurvaste kleuring.

Zo is zuurbestendige kleuring, vergelijkbaar met gramkleuring, een differentiële kleuringmethode, die bacteriën op basis van de aard van hun celwand als volgt in twee groepen differentieert:

(1) Zuursnelle bacteriën:

Een bacterie, die uiterst moeilijk te kleuren is, maar eenmaal gekleurd, is het net zo moeilijk om de vlek uit de cellen te verwijderen, zelfs met krachtig gebruik van zuur-alcohol als ontkleuringsmiddel, is het een zuurvaste bacterie (zuurminnend) bacteriën).

Voorbeelden: Mycobacterium spp. [M. tuberculose (TB-bacteriën), M. leprae (leprabacteriën), M. smegmatis (natuurlijke bacteriën van smegma) en M. marinum (TB-bacteriën van zeevissen). Ze bezitten een dikke wasachtige celwand gemaakt van lipide materialen.

(2) Niet-zuurvaste bacteriën:

Een bacterie, die gemakkelijk te kleuren is en ook gemakkelijk kan worden ontkleurd door zuuralcohol als ontkleuringsmiddel, is een niet-zuurvaste bacterie (niet-zuurminnende bacterie). Voorbeelden: alle bacteriën behalve Mycobacterium spp. In deze bacteriën is de celwand niet dik en wasachtig.

Zure-snelle kleuring is nuttig bij het differentiëren van zuurvaste en niet-zuurvaste bacteriën en ook bij de identificatie van bacteriën die behoren tot het geslacht Mycobacterium.

Beginsel:

De zuurvaste bacteriën verschillen van de niet-zuurvaste bacteriën doordat ze een dikke wasachtige celwand hebben die is gemaakt van lipidematerialen. Gewone waterige vlekken, zoals methyleenblauw of kristalviolet, kunnen via deze wasachtige celwand niet in hun cellen binnendringen.

De roodgekleurde fenolische primaire vlek carbol fuchsine (carbolzuur of fenol + basische fuchsine); die oplosbaar is in de lipide-materialen van de celwand, door de celwand in hun cellen kan binnentreden en kan worden vastgehouden in de cellen waardoor ze een rode kleur krijgen.

Penetratie wordt verder versterkt door toepassing van warmte, die carbol fuchsine door de lipoidale wand in het cytoplasma drijft. (Een kleine wijziging van deze Ziel-Neelsen-methode beschrijft de toevoeging van een bevochtigingsmiddel, Turgitol, aan de vlek, die de oppervlaktespanning tussen de celwand en de vlek vermindert, waardoor geen verwarming nodig is). De cellen worden toegestaan af te koelen, om de wasachtige celwand uit te harden.

Wanneer de cellen worden blootgesteld aan het ontkleuringsmiddel, zure alcohol, weerstaan ze ontkleuring, omdat de primaire vlek oplosbaarder is in de cellulaire wassen dan in het ontkleurende middel. Vervolgens, wanneer tegengekleurd met methyleenblauw, kan het de cellen niet binnengaan door de wasachtige celwand.

Ten slotte behouden de zuurvaste bacteriën de rode kleur van de primaire vlek en lijken ze rood. Aan de andere kant nemen de niet-zuurvaste bacteriën de primaire vlek gemakkelijk op en ondergaan gemakkelijk ontkleuring. Wanneer ze kleurloos zijn gekleurd met methyleenblauw nemen ze ook gemakkelijk de tegenkleuring op en lijken ze blauw, in tegenstelling tot de zuurvaste bacteriën die rood lijken.

Vereiste materialen:

Schuif, lus, primaire vlek (carbol fuchsine), ontkleuringsmiddel (zuur-alcohol), tegenkleuring (methyleenblauw), hete plaat, bouillon / helling / plaatcultuur van bacteriën, microscoop, immersieolie.

Procedure:

1. Een dia wordt op de juiste manier gereinigd onder leidingwater, zodat water niet als druppels op het oppervlak achterblijft (Figuur 5.12).

2. Het aanhangende water wordt weggevaagd met absorberend papier en de dia wordt aan de lucht gedroogd.

3. Een uitstrijkje van bacteriën wordt als volgt in het midden van de schuif op twee manieren voorbereid.

(a) Als de op agarplaat of agarhoek gekweekte bacteriën worden waargenomen, wordt een druppel water in het midden van de glijbaan gelegd en een lus van bacteriën van de plaat of helling wordt er door een lus gesteriliseerd over de vlam naar overgebracht . Vervolgens, door langzame rotatie van de lus in de druppel, wordt een suspensie van bacteriën gemaakt en deze wordt uitgespreid tot een uitstrijkje wordt verkregen.

(b) Als bacteriën die in vloeibare bouillon zijn gegroeid worden waargenomen, wordt een druppel van de bacteriesuspensie direct in het midden van de schuif geplaatst door een vlamgesteriliseerde lus en wordt een uitstrijkje gemaakt door uitspreiden.

4. Het uitstrijkje is aan de lucht gedroogd.

5. Het uitstrijkje wordt verhit door verhitting. Verwarmen resulteert in de coagulatie van de cellulaire eiwitten, waardoor de cellen aan het oppervlak van de glijbaan blijven kleven en tijdens de kleuring niet worden weggewassen. Warmte-fixatie wordt gedaan door de schuif snel hoog boven een vlam 2-3 keer te laten passeren, met het uitstrijkoppervlak naar boven gericht, zodat het uitstrijkje niet opgewarmd raakt.

6. Het uitstrijkje wordt overspoeld met karbon fuchsin

7. De schuif wordt op een warme hete plaat geplaatst, zodat het preparaat 5 minuten kan stomen. De temperatuur van de kookplaat wordt zo aangepast dat de bereiding niet kookt en snel verdampt. Het verdampingsverlies wordt bijgevuld, zodat het uitstrijkje niet opdroogt. (Voor de niet-doorlatende methode wordt het uitstrijkje gedurende 3-5 minuten ondergedompeld met carbol fuchsine dat Turgitol bevat).

8. De schuif wordt van de hete plaat verwijderd en afgekoeld.

9. Overtollige vlekken worden weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, zodanig dat water niet rechtstreeks op het uitstrijkje valt.

10. Het ontkleuringsmiddel, zuuralcohol, wordt druppel voor druppel op het uitstrijkje toegevoegd totdat carbol fuchsine er niet in slaagt om uit het uitstrijkje te spoelen.

11. De zuur-alcohol wordt weggespoeld van het uitstrijkje onder licht stromend leidingwater, zodanig dat er geen water rechtstreeks op het uitstrijkje valt.

12. Het uitstrijkje wordt gedurende 2 minuten met de tegenkleuring, methyleenblauw, overstroomd.

13. Overtollige tegenvlek wordt weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, zodanig dat er geen water rechtstreeks op het uitstrijkje valt.

14. De dia is droog geblazen met absorberend papier.

15. De dia wordt op het microscoopstadium geknipt en het uitstrijkje wordt waargenomen bij een laag energieverbruik en hoge droge doelen.

16. Een druppel onderdompelingsolie wordt op het uitstrijkje aangebracht.

17. Het uitstrijkje wordt waargenomen onder het doel om olie te dompelen.