Experiment om Gram-kleuring van bacteriën uit te voeren (met afbeelding)
Lees dit artikel om meer te weten te komen over het experiment om gramkleuring van bacteriën uit te voeren om erachter te komen of het gram-positief of gram-negatief is!
Doel:
De belangrijkste differentiële kleuring die wordt gebruikt in de microbiologie is gramkleuring.
Het is vernoemd naar Dr. Christian Gram die bacteriën, op basis van de verschillen in de samenstelling van hun celwand, als volgt indeelde in twee groepen:
(1) Gram-positieve bacteriën:
Na het kleuren van een bacterie met kristalviolet, als de celwand weerstand biedt aan ontkleuring door wassen met een ontkleurende stof (ethanol of aceton), is het een gram-positieve bacterie. Voorbeelden: Bacillus, Staphylococcus.
(2) Gramnegatieve bacteriën:
Na het kleuren van een bacterie met kristalviolet is het, als de celwand ontkleuring toelaat door te wassen met een ontkleurende stof (ethanol of aceton), een gramnegatieve bacterie. Voorbeelden: Escherichia, Salmonella, Vibrio.
Differentiatie van bacteriën in grampositieve en gramnegatieve groepen vormt de belangrijkste aanwijzing om verder te gaan in de juiste richting voor identificatie van onbekende bacteriën. Het is ook nuttig voor eenvoudige differentiatie van bacteriën in gram-positieve en gram-negatieve groepen. Het geeft ook een idee over de vorm en opstelling van de bacteriecellen.
Beginsel:
Bij gramkleuring worden de bacteriecellen eerst gekleurd met een primaire vlek, kristalviolet die in de cellen binnendringt en ze paarsblauw kleurt. Vervolgens worden de cellen behandeld met een jodiumhoudend bijtmiddel, gram, dat in de cellen binnendringt en zich bindt aan de primaire vlek, waarbij een onoplosbaar kleurstofbindend complex (kristalviolet-jodiumcomplex) wordt gevormd, waardoor het ontsnappen van de vlek moeilijk wordt.
Vervolgens worden de cellen behandeld met een ontkleurende stof, zoals ethanol of aceton. Het werkt als een lipide-oplosmiddel en als een eiwit-dehydratatiemiddel. In gram-positieve cellen werkt het ontkleurende middel initieel als een lipideoplosmiddel, waarbij de kleine hoeveelheid lipide die in de celwand aanwezig is wordt opgelost, waardoor minuscule poriën erin worden gevormd. Vervolgens ontwatert het de celwandproteïnen (peptiden), die de poriën sluiten.
Nu is het vlekvormende complex moeilijk te verwijderen door het ontkleurende middel en behouden de cellen de paarsblauwe kleur van de primaire vlek. Wanneer tegengekleurd door een roze-rood gekleurde vlek, safranin, kan het de cellen niet binnengaan, omdat de poriën gesloten zijn.
De cellen behouden uiteindelijk de paarsblauwe kleur van de primaire vlek. Anderzijds bevat de gramnegatieve celwand een grote hoeveelheid lipide (LPS), die wordt opgelost door het ontkleurende middel, wat resulteert in de vorming van grote poriën. Deze poriën sluiten niet merkbaar op uitdroging van celwandproteïnen.
Dat is de reden; het vlekvormende complex ontsnapt door de poriën, wanneer het wordt gewassen door het ontkleurende middel en de cellen lijken kleurloos. Wanneer contra-gekleurd door safranin, komt het in de cellen door de poriën binnen en uiteindelijk nemen de cellen de rozerode kleur van de tegenvlek.
Vereiste materialen:
Dia, lus, primaire vlek (kristalviolet), beitsmiddel (jodium van gram), ontkleuringsmiddel (95% ethanol), tegenkleuring (safranin), kweek / helling / plaatcultuur van bacteriën, microscoop, immersieolie.
Procedure:
1. Een dia wordt op de juiste manier gereinigd onder leidingwater, zodat water niet als druppels op het oppervlak achterblijft (Figuur 5.11).
2. Het aanhangende water wordt weggevaagd met absorberend papier en de dia wordt aan de lucht gedroogd.
3. Een uitstrijkje van bacteriën wordt als volgt in het midden van de schuif op twee manieren voorbereid.
(een) Als een op agarplaat of agarhoek gekweekte bacterie moet worden waargenomen, wordt er een druppel water in het midden van de glijbaan gelegd en een lus van bacteriën van de plaat of helling wordt er door een met lus gesteriliseerde vlam overgebracht. Vervolgens, door langzame rotatie van de lus in de druppel, wordt een suspensie van bacteriën gemaakt en deze wordt uitgespreid tot een uitstrijkje wordt verkregen.
(B) Als een in vloeibare bouillon gekweekte bacterie moet worden waargenomen, wordt een druppel van de bacteriesuspensie direct in het midden van de schuif geplaatst door een vlamgesteriliseerde lus en wordt een uitstrijkje gemaakt door uitspreiden.
4. Het uitstrijkje is aan de lucht gedroogd.
5. Het uitstrijkje wordt verhit door verhitting. Verwarmen resulteert in coagulatie van de cellulaire eiwitten, waardoor de cellen aan het oppervlak van de glijbaan blijven plakken en tijdens de kleuring niet worden weggespoeld. De warmte wordt gefixeerd door de glijbaan hoog boven een vlam 2-3 keer snel te laten passeren, met het uitstrijkje oppervlak naar boven gericht, zodat het uitstrijkje niet opwarmt.
6. De dia wordt op een kleuringslade gehouden en wordt gedurende 1 minuut met de primaire vlek, kristalviolet, overstroomd.
7. Overtollige vlekken worden weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, zodanig dat water niet rechtstreeks op het uitstrijkje valt.
8. Het uitstrijkje wordt gedurende 1 minuut overspoeld met het bijtmiddel, gram jodium.
9. Overtollige beitsen worden weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, zodanig dat water niet rechtstreeks op het uitstrijkje valt.
10. Het uitstrijkje wordt gedurende 5 seconden met het ontkleurende middel, 95% ethanol, ondergedompeld en zorgt ervoor dat het uitstrijkje niet overmatig ontkleurd is.
11. De ethanol wordt snel weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, om oververkleuring te voorkomen. Er wordt op gelet dat water niet rechtstreeks op het uitstrijkje valt.
12. Het uitstrijkje wordt gedurende 1 minuut met de tegenkleuring, safranin, overstroomd.
13. Overtollige tegenvlek wordt weggespoeld van het uitstrijkje onder zacht stromend leidingwater, zodanig dat er geen water rechtstreeks op het uitstrijkje valt.
14. De dia is droog geblazen met absorberend papier.
15. De dia wordt op het microscoopstadium geknipt en het uitstrijkje wordt waargenomen bij een laag energieverbruik en hoge droge doelen.
16. Een druppel onderdompelingsolie wordt op het uitstrijkje aangebracht.
17. Het uitstrijkje wordt waargenomen onder het doel om olie te dompelen.
Observations (Under Oil-immersion Objective):
1. Kleur van de cellen:
Paarsblauw: grampositieve bacteriën
Rozerood: gramnegatieve bacteriën
2. Vorm van bacteriën:
Bolvormig (coccus)
Staafvormig (bacilli)
Komma-achtig (vibrio)
Spiraal (spirocheten)
3. Regeling van bacteriën:
Paren (diplobacillus / diplococcus)
In vieren (tetrads)
In ketens (streptococcus / streptobacillus)
Druifachtige clusters (staphylococcen)
Cuboidal (sarcinae of octet)
4. Grootte van bacteriën:
Maak met behulp van het oog een tekening van het veld onder het object met olie-immersie.
Gram-variabele reactie:
In sommige gevallen verschijnen de grampositieve cellen als gramnegatieve cellen. Dit wordt een gram-variabele reactie genoemd.
De redenen zijn als volgt:
(a) Oververkleuring kan optreden, waardoor de gram-positieve cellen ook hun violette kleur verliezen.
(b) Overmatige fixatie kan optreden, waardoor de grampositieve cellen hun vermogen verliezen om ontkleuring te weerstaan
(c) Als oude bacteriëncultuur wordt gebruikt, kunnen de componenten van de celwand veranderen met de ouderdom van de cellen die ontkleuring mogelijk maken.
