Cryopreservatie van gameten in vissen
In dit artikel zullen we het hebben over cryopreservatie van gameten in vissen.
De cryopreservatie is een opslagtechniek met praktisch geen tijdslimieten. Het conserveren van visgameten is geprobeerd met deze techniek. De cryopreservatie van sperma is een goed ingeburgerde procedure in de veehouderij.
Nu worden gecryopreserveerde spermacellen met succes gebruikt bij de inseminatie van rundvee, paarden, varkens, schapen en pluimvee. Het is interessant op te merken dat er grote inspanningen zijn geleverd om deze technologie over te dragen aan het behoud van sperma, eicellen en embryo's van vissen.
Deze techniek zal de viskwekers op de volgende manieren helpen:
(1) Het probleem van niet-toeval-rijping van man en vrouw kan overwinnen als sperma of eicellen in opslag worden gehouden.
(2) Het programma van selectief fokken kan worden uitgevoerd dat de inheemse bestanden zal verbeteren en de derde wereld zal helpen hun inheemse soorten te kweken en speciale spanningen van superieure stengel te produceren.
(3) De techniek van cryopreservatie van gameten zal een belangrijke rol spelen bij de instandhouding van inheemse germplasm omdat veel van de inheemse Indiase vissen niet kunnen concurreren met exotische vissen. Door deze techniek worden de gameten van bedreigde soorten geboot als een hedge tegen afnemende genetische variabiliteit veroorzaakt door omgevingsstoringen.
(4) Het kan helpen bij de productie van een monoseksuele cultuur.
(5) Als gameten met succes kunnen worden bewaard, kunnen we het hele jaar door vis ontwikkelen volgens onze vereisten en kunnen we genenbanken helpen creëren om de genetische originaliteit van de populatie te behouden en ze beschikbaar houden voor herintroductie wanneer de algemene overlevingsvoorwaarden zijn verbeterd.
De sperma, eieren en embryo's kunnen worden gecryopreserveerd, maar het conserveren van eieren en embryo's is moeilijk omdat de beschikbaarheid van cryoprotectant onvoldoende wordt geabsorbeerd in deze cellen vanwege hun grote omvang in vergelijking met spermatozoa.
De cryopreservatie van spermatozoa bij vissen is succesvol bij de mens; soorten Deze soorten zijn Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius en Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo rohita, Catla catla en Cirrhinus mrigala.
De volgende stappen moeten worden gevolgd bij het behoud van spermatozoa:
(1) Verzameling van milt (sperma).
(2) Bereiding van verlengingsoplossing.
(3) Selectie van cryoprotectant.
(4) Invriezen.
(5) Succes bij bevruchting.
Verzameling van Milt:
De eerste stap is het verzamelen van sperma. Normaal gesproken worden de spermacellen door strippen uit gezonde vissen verzameld. De katheter kan worden gebruikt, wat een beter alternatief is voor strippen. De mannelijke kwekers met de beste karakteristieke eigenschappen werden geselecteerd en gewassen met Ringers-oplossing en het genitale papillaegebied werd gedroogd.
De broedmachine kan worden geanesthetiseerd of niet worden verdoofd. De algemeen gebruikte anesthesie is 0, 3 ml / l fenoxyethanol. Volgens Kumar (1989) geeft een injectie met suston 250 (organon) voorafgaand aan het strippen een beter resultaat in Indiase karpers. De meerderheid van de werknemers in dit gebied heeft niet-verdoofde vissen aanbevolen om te strippen voor het verkrijgen van milt.
De milt wordt verzameld in spuiten of hemolysebuizen en later bewaard in glazen ampullen (verzegeld of niet-verzegeld), plastic rietjes en vaak in plastic zakken. De kleur, het volume, de dichtheid, de pH en de beweeglijkheid van sperma zijn opvallend.
Het monster moet vrij zijn van urine- en ontlasting. Een uitstrijkje van het monster moet onder de microscoop worden onderzocht om abnormaliteiten in het sperma te ontdekken. Als het monster in orde is, breng het dan aan voor verdere verwerking, anders kan vers monster van nieuwe kwekers worden genomen.
Tijdens de periode van verzameling en bewaring van spermatozoa, kunnen de spuit / ampullen / rietje in vijverwater worden bewaard om een constante temperatuur te handhaven. Legendary en Billard (1980) verzamelden sperma in hemolysisbuizen in smeltend ijs en werden vervolgens bewaard op een gekoeld oppervlak bij 4 ° C.
De voorbereiding en selectie van extender, een oplossing waarin milt wordt verzameld, is het meest kritisch voor cryopreservatie. De extender voorkomt de uitputting van de energie van het sperma en houdt het sperma in een rustige toestand, maar levend.
Er zijn twee basisverlengers. Ze worden Mounibs medium (M) en Menezo medium (Me) genoemd. In deze twee media worden runder-serun-albumine (BSA) en telluriet-eigeel toegevoegd. Voor Indiase vissen werden verschillende extenders geprobeerd door ze in hun volgende bestanddelen te modificeren.
De gemeenschappelijke bestanddelen zijn natriumchloride, KCI, CaCl2, NaHC03, Na2HP04 en MgS04. Naast deze worden voedingsstoffen en glycine ook toegevoegd om cryopreservatie te verbeteren. Antibiotica zoals gentomycine of streptomycine worden indien nodig ook aan de extenderoplossing toegevoegd.
cryoprotectant:
De belangrijkste functie van de cryoprotectans is doordringen in de cel en kan spermatozoa helpen de vriestemperatuur te verdragen. De belangrijkste en meest gebruikte zijn DSMO (dimethylsulfoxide) en glycerol. Harvey (1983) gebruikte methanol, DSMO en glycerol in combinatie met melkpoeder of eierdooier.
Cryoprotectant en verlengingsoplossing in een vaste verhouding, in het algemeen een deel van het koude beschermend middel en negen delen van de verlengingsoplossing is bekend als verdunningsmiddel. In dit verdunningsmiddel worden de spermacellen verzameld voor verdere verwerking voor bevriezing.
Het verdunningsmiddel (cryoprotectant + extender + spermacellen) wordt in polyvinylstro's genomen en beide uiteinden van rietjes worden geseald en nu zijn ze klaar om te bevriezen of te koelen. De milt kan worden gekoeld, de temperatuur wordt gehandhaafd tussen 0-5 ° C. Tijdens het vriezen worden CO 2 en vloeibare stikstof gebruikt. Gekoelde opslag van teleost milt (0-50 ° C) is uitgebreid bestudeerd in Salmonids.
In de vriesprocedure moeten veel problemen zoals koude shock, vorming van intracellulair ijs en osmotische shock worden beheerst. Cryopreservatie betekent in het algemeen opslag van cellen of weefsel bij -196 o C, de temperatuur van vloeibare stikstof (Fig. 22.1).
Celverwonding moet worden beheerst. In het algemeen treden drie soorten celbeschadiging op. De eerste is koude shock, die wordt veroorzaakt door koeling boven temperaturen onder het vriespunt. Dit is belangrijker voor eicellen, niet erg belangrijk voor sperma.
Dit gebeurt tot 0 ° C. Wanneer de temperatuur tussen 0 ° C en -80 ° C loopt, vindt de osmotische shock en de vorming van intracellulair ijs in de eicellen en het sperma plaats. Voor succesvolle cryopreservatie worden deze zaken gecontroleerd.
In het kort, de rietjes die verdunningsmiddel bevatten, worden overgebracht in blikken. De bussen die rietjes vasthouden nadat een verschillende equilibratieperiode is toegestaan, worden eerst ondergedompeld in vloeibare stikstofdampen en vervolgens in vloeibare stikstof bij een temperatuur van -196 ° C. Legendra en Billard (1980) bewaarden het sperma van regenboogforellen in droog ijs (vast CO 2 -79 ° C) of in vloeibare stikstof tot 6 maanden.
In een aantal zoetwatersoorten is het bevriezen uitgevoerd door suspensiesperma tot droogijs te pelleteren. De overgang van 0 ° C naar -70 ° C duurt ongeveer 2 minuten, wat resulteert in een snelheid van 35 o C / min. Aangezien de snelheid afneemt boven -60 ° C. De beste resultaten worden verkregen in vloeibare stikstof.
ontdooien:
Het ontdooien is omgekeerd bij bevriezing. Ontdooien gebeurt in een waterbad bij temperaturen van 10 ° C tot 60 ° C. Het succes van de hele procedure hangt af van de beweeglijkheid van spermatozoa en het vermogen om eicellen te bevruchten.
Stoss en Holtz (1982) hebben de beweeglijkheid van pink salmon spermatozoën verhoogd van 30 sec tot 10 minuten door te activeren met een 120 nm NaHC03 oplossing waaraan 1 BMX (3-isobutyl-1-methyl xanthium) was toegevoegd. Kumar (1989) stelde dat de opslagduur ongeveer 20 dagen is in L. rohita en H. molitrix onder cryogene omstandigheden.
De eieren van Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch en O.keta werden gefixeerd door verwijdering door het proces van strippen en verzegelen in plastic zakken samen met coelomische vloeistof en onder zuurstof gehouden bij 1 ° C. De eieren mogen zich vervolgens verspreiden om een laag één of twee eieren diep te vormen.
De eieren werden vervolgens gemengd met extender-oplossing en cryoprotectans bijna op vergelijkbare wijze als eerder beschreven voor sperma. Volgens Harvey en Kelley (1984) is de niet-bevroren (gekoelde) opslag van eicellen matig succesvol geweest bij zalmachtigen, met opslagtijden in de orde van enkele weken verkregen door koeling van geoxygeneerde eieren in coelomische vloeistof.
