Western Blotting of Proteins
Western Blotting of Proteins!
Eiwitten worden gedenatureerd door incubatie met een ionisch detergens (SDS: natriumdodecylsulfaat) bij 100 ° C.
SDS bedekt alle eiwitten uniform en maakt de oppervlaktelading van de eiwitten negatief.
↓
Het gedenatureerde eiwit wordt vervolgens geëlektroforeerd in polyacrylamidegel. De eiwitten worden gescheiden als afzonderlijke banden afhankelijk van hun molecuulgewichten.
↓
De gescheiden eiwitten worden elektroforetisch bondgenoot overgebracht naar een filterpapier (nylon of nitrocellulose).
↓
Het filterpapier wordt vervolgens geïncubeerd met antisera tegen de eiwitten. De antilichamen binden aan hun overeenkomstige eiwitantigenen op het filterpapier en vormen antigeen-antilichaamcomplexen.
↓
Het filterpapier wordt gewassen om niet-gebonden serumcomponenten te verwijderen.
↓
Enzym-gelabeld anti-immunoglobuline (bekend als conjugaat) wordt aan het filterpapier toegevoegd en geïncubeerd.
↓
Het conjugaat bindt aan het antilichaam in het antigeen-antilichaamcomplex in het filterpapier.
↓
Het filterpapier wordt gewassen om ongebonden conjugaat te verwijderen en substraat wordt toegevoegd en geïncubeerd.
ik. Gekleurde banden ontwikkelen zich op plaatsen waar er antigeen-antilichaamcomplexen zijn.
iii. Niet-ontwikkeling van de band suggereert dat het overeenkomstige antilichaam tegen het antigeen afwezig is in het testserum.
Het filterpapier geïmpregneerd met antigenen kan langere tijd worden bewaard.
De Western Blot-assay wordt veel gebruikt voor het detecteren van antilichamen tegen hepatitis C-virus en als een bevestigende test voor de detectie van antilichamen tegen het humane immunodeficiëntievirus (HIV).
Commerciële bedrijven impregneren filterpapieren met gescheiden HIV-antigenen en leveren aan de laboratoria. In het laboratorium wordt het serum van de patiënt aan het filterpapier toegevoegd en verwerkt om de aanwezigheid van HIV-specifieke antilichamen in het serum te detecteren.
radioimmunoassay:
Radioimmunoassay (RIA) werd voor het eerst ontwikkeld door Rosalin Yalow en Berson (1959). Er zijn talloze variaties in de methode geïntroduceerd. Er zijn twee belangrijke RIA-technieken, concurrerende RIA en niet-competitieve RIA.
Verschillende radio-isotopen worden gebruikt als labels (Tabel 27.4) en de radioactieve emissies worden gemeten in termen van tellingen per minuut (CPM) met behulp van een scintillatieteller. Het meest populaire label, 125 I, vereist een kortere tijd voor signaaltelling, maar het heeft een beperkte houdbaarheid vanwege de korte halfwaardetijd. Tritium (3H) radio-isotoop vereist een langere tijd voor het tellen en daarom wordt de totale assaytijd verhoogd.
De voordelen van RIA zijn:
ik. Precisie en hoge kwaliteit
ii. Isotopenconjugatie is eenvoudig
iii. Signaaldetectie zonder optimalisatie
Tabel 27.4: Eigenschappen van radio-isotopen die worden gebruikt in radio-immunoassays:
Isotoop | Halve leven | Type van verval | Specifieke activiteit (mCi / μmol) |
125 I | 60 dagen | γ | 2200 |
131 I | 8, 1 dagen | Β-, γ | 16.100 |
3 H | 12, 3 jaar | β- | 29 |
14 C | 5760 jaar | β- | 6062 |
32 p | 14.3 dagen | β- | 9120 |
RIA heeft echter de volgende nadelen
ik. Korte halfwaardetijd van reagentia
ii. Risico's van radioactiviteit.
