Nuttige opmerkingen over Lymphocyte Activatie Assays
De functionele mogelijkheden van lymfocyten in reactie op antigenen of mitogenen worden bepaald door lymfocytactiveringsassays.
Vandaar dat lymfocytenactiveringsassays geschikter zijn om de immunocompetentie van het individu te bepalen dan een eenvoudige telling van lymfocyten.
Er zijn twee soorten lymfocytactiveringsassays:
ik. Detectie van 'activeringsmarkers' op het lymfocytoppervlak.
ii. Beoordeling van het vermogen van lymfocyten om te prolifereren na T-celstimulatie.
De meest algemeen gebruikte T-celstimuli om T-lymfocytproliferatie vast te stellen zijn:
ik. Lectinen [zoals fytohemagglutinin (PHA), en concanavalin A (ConA)
ii. Bacteriële toxinen die werken als super-antigenen
iii. Chemische verbindingen [zoals forbolmyristaatacetaat (PMA), calciumionoforen
iv. cytokines
v. mAbs tegen oppervlakte-receptoren (vooral CD3-moleculen op T-cellen)
B-celactivering wordt veroorzaakt door:
ik. Pokeweed mitogen (PWM). PWM activeert ook T-cellen
ii. Super antigenen
iii. lipopolysacchariden
iv. mAbs die slgs op het oppervlak van de B-cel verknopen.
een. Gezuiverde lymfocyten worden gekweekt in microtiterputjes met 96 putjes en gestimuleerd met antigeen of mitogeen (gewoonlijk gedurende 48 uur).
↓
Getritieerd thymidine (3H-Tdr) wordt aan de putjes toegevoegd en geïncubeerd
↓
De inhoud van de putjes wordt doorgezogen en gefilterd op filters en de hoeveelheid 3H Tdr in het filterpapier wordt gemeten. De incorporatie van 3H-Tdr in chromosomaal DNA weerspiegelt celproliferatie.
b. Er zijn niet-radioactieve assays om de proliferatie van cellen te bepalen. Deze testen maken gebruik van fluorescente kleurstoffen die zijn opgenomen in DNA of kleurstoffen die oxidatieve ademhaling meten, zoals MTT.
c. Bromodeoxyuridine (BrdU) wordt opgenomen in het DNA van sterk replicerende cellen en kan daarom worden gebruikt om celproliferatie vast te stellen. De geïncorporeerde BrdU in cellen wordt gedetecteerd door gebruik te maken van mAbs tegen BrdU en flowcytometrie (zoals detectie van intracellulaire antigenen door flowcytometrie).
BrdU kan ook in vivo aan kankerpatiënten worden toegediend en de tumor kan later worden geresecteerd en de tumorcellen kunnen worden beoordeeld op de opname van BrdU. Deze test geeft een idee over de proliferatieve fractie van tumorcellen bij een patiënt.
d. Cytotoxische T-celactivatie wordt bepaald met behulp van 51 chromium release assay:
Doelwitcellen zijn gelabeld met radioactief chroom (51Cr), dat bindt aan intracellulaire eiwitten van de doelwitcellen.
↓
De gelabelde doelcellen worden geïncubeerd met cytotoxische T-cellen.
↓
Target cellysis door de cytolytische T-cellen resulteert in de afgifte van de 51 Cr.
De cellen worden gecentrifugeerd en de afgegeven 51Cr in het supernatant wordt gemeten. De hoeveelheid vrijgekomen 51Cr is evenredig met de lysis van cellen.
