Neutrofiel-functietesten
Neutrofiel-functietesten!
1. Chemotaxis van neutrofielen kan op de volgende manieren worden beoordeeld:
een. Gemodificeerde Boyden-kamerassay:
De Boyden-kamer bestaat uit een bovenste en een onderste kamer gescheiden door een filter met een kleine poriegrootte.
De neutrofiele suspensie wordt in de bovenste kamer geplaatst en een chemotactische stof wordt in de onderste kamer geplaatst. De mate van migratie van neutrofielen wordt vastgesteld door het aantal neutrofielen dat is opgesloten in het filter en het aantal neutrofielen in de onderste kamer te tellen door middel van flowcytometrie.
b. Putjes worden uitgestanst in een halfvaste agar:
Neutrofiele suspensie, chemotactische substantie en een niet-chemotactische substantie worden in verschillende putjes geplaatst. De migratie van cellen door de semi-vaste agar naar de put met chemotactische stof wordt microscopisch bepaald. Migratie naar de niet-chemotactische stof vertegenwoordigt goed de willekeurige beweging van cellen (bekend als chemo kinesis).
2. Neutrofiele fagocytose:
Een verscheidenheid aan deeltjes kan worden gebruikt om de fagocytische capaciteit van de neutrofielen vast te stellen. De deeltjes worden geïncubeerd met neutrofielen en later microscopisch waargenomen op de aanwezigheid van de deeltjes in de neutrofielen. De celoppervlak-gebonden deeltjes worden verwijderd met zuurbehandeling, zodat de celoppervlak-gebonden deeltjes niet worden geteld als intracellulaire deeltjes.
Fluorescerende gelabelde of radioactieve deeltjes die directe telling van deeltjes door fagocyten mogelijk maken, zijn nu ook beschikbaar.
3. Bepaling van ademhalingsburst en degranulatie:
Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een immunodeficiëntie waarbij de intracellulaire doding door fagocyten wordt beïnvloed door het onvermogen van de fagocytische cellen om superoxide-anion (O 2 - ) te produceren.
een. Nitroblauwtetrazolium (NBT) glaasje test:
NBT is een heldere, gele, in water oplosbare kleurstof. NBT wordt gereduceerd tot een diepblauwe, formazon door O 2 - . De neutrofielen worden geactiveerd door behandeling met PMA of blootstelling aan LPS. De geactiveerde neutrofielen worden vervolgens geïncubeerd met NBT. Als de neutrofielen O 2 - produceren, wordt de NBT gereduceerd tot diepblauwe formazon en wordt deze zichtbaar gemaakt onder een microscoop. Een kwantitatieve assay kan worden uitgevoerd door de formazon uit de neutrofielen te extraheren en de formazon door een spectrofotometer te testen. Kinderen met een volledig tekort aan NADPH-oxidase-activiteit vertonen een groot tekort in de NBT-test. Maar kinderen met gedeeltelijk verlies van NADPH-oxidase-activiteit worden beter gedetecteerd door kwantitatieve assay.
b. Flowcytometrische test met behulp van 2'7'-dichloor-fluoresceïne (DCF):
De O 2 - gevormd tijdens NADPH-oxidase-activiteit wordt omgezet in H 2 O 2 door het enzym superoxide-dismutase. H 2 O 2 is een andere microbicidale chemische stof. H 2 O 2 oxideert de niet-fluorescerende verbinding DCF naar een fluorescerende verbinding, die wordt gedetecteerd door de flowcytometer.
Fagocyten worden geïncubeerd met DCF en DCF komt de cellen binnen.
↓
Vervolgens worden de neutrofielen geactiveerd door PMA of andere middelen.
↓
Vervolgens worden de cellen geanalyseerd in de flowcytometer. Een toename in de fluorescentie van de fagocyten wordt bepaald.
Flowcytometer maakt ook de kwantitatieve bepaling van H202 geproduceerd door individuele cellen mogelijk. Vandaar dat de flowcytometrische analyse nuttig is bij de detectie van partiële defecten in de NADPH-oxidasefunctie of voor screening op heterozygote dragers van de X-gekoppelde vorm van CGD.
4. Phagocyte degranulatie:
Fagocytische degranulatie is een proces van fusie van lysosomen met fagosomen, wat leidt tot de afvoer van lysosomale inhoud in het fagolysosoom. Degranulatie is een actief proces en vereist energie. De verslechtering van normale metabolische routes van neutrofielen (in het bijzonder zuurstofverbruik en het metabolisme van glucose door de hexose monofosfaatshunt) interfereert met degranulatie; bijgevolg wordt intracellulair doden van microben door de fagocyten beïnvloed.
Degranulatie van fagocyten in een suspensie kan worden geïnduceerd door verschillende activerende middelen en verbindingen die het cytoskelet van de cel beïnvloeden (zoals cytochalasine B). De fagocyten geven voornamelijk de secundaire en tertiaire korrels af en ze worden gemeten met behulp van ELISA-methoden.
ik. Lactoferrine (een secundaire neutrofiele granule) wordt gebruikt als een marker voor de afgifte van secundaire granules.
ii. Albumine wordt getest als een maat voor de afgifte van tertiaire granules.
Assay voor afgifte van primaire granulaten uit fagocyten wordt gedaan door te zoeken naar afgifte van primaire granules in ingesloten ruimten. "Gefrustreerde fagocytose" is een test die wordt gebruikt om de afgifte van primaire korrels te beoordelen (figuur 27.7).
Warmte-geaggregeerde immunoglobulinen of immuuncomplexen zijn gefixeerd aan een petrischaal.
↓
Neutrofielen worden aan de petridish toegevoegd en geïncubeerd. Via hun Fc-receptoren binden de neutrofielen aan de Fc-gebieden van door warmte geaggregeerde immunoglobuline- of immuuncomplexen. Dientengevolge proberen de neutrofielen de door warmte geaggregeerde immunoglobuline- of immuuncomplexen te fagocyteren. Maar de neutrofielen kunnen ze niet fagocytoseren (omdat ze zijn bevestigd aan de petrischaal). Dientengevolge laten de neutrofielen hun korrelige inhoud erover vrij.
↓
De afgiftesnelheid van primaire granule-eiwitten, zoals myeloperoxidase of β-glucoronidase, wordt gebruikt om de degranulatie te schatten. Tekorten in de synthese van primaire / secundaire korrels kunnen ook worden gedetecteerd door intracellulaire korrels te kleuren met gemerkte mAb's en flowcytometrie.
Bacterial Killing door Neutrophils:
Microbicidal assays zijn moeilijk uit te voeren. In het algemeen worden microbicidale assays uitgevoerd wanneer meer eenvoudige assays niet voldoende informatie verschaffen.
Staphylococcus aureus stam 502A wordt vaak gebruikt om de microbicidale capaciteit van de neutrofielen vast te stellen.
Staphylococcus aureus stam 502A groeiend in logfase worden geïncubeerd met menselijke sera (om immunoglobuline's te verschaffen en eiwitten te complementeren om op te treden als opsoninen).
↓
Vers geïsoleerde neutrofielen worden toegevoegd in een concentratie van 5-10 bacteriën / neutrofielen.
↓
Na 30 minuten incubatie worden de bacteriën die niet worden ingevuld door de neutrofielen gedood door de toevoeging van het geneesmiddel gentamicine. (Gentamidn treedt niet in neutrofielen en daarom blijven gefagocyteerde bacteriën in leven.)
↓
Hoeveelheden neutrofielen worden verwijderd met intervallen van 30 minuten en gemengd met steriel gedestilleerd water om de neutrofielen te lyseren en de bacteriën vrij te maken. Het aantal levensvatbare bacteriën in elke aliquot wordt gemeten door seriële verdunning van en plateren op bloedagarplaten.
↓
De resultaten worden in een grafiek uitgezet.
ik. Normale neutrofielen vertonen een vermindering van twee logs in levensvatbare intracellulaire bacteriën na één uur incubatie.
ii. Nagenoeg geen doden door de neutrofielen van homozygote CCD-patiënten.
iii. Neutrofielen van heterozygote CGD-dragers vertonen gedeeltelijke doding door de neutrofielen.
