HLA: Histocompatibiliteitstestmethoden

Histocompatibiliteitstestmethoden!

Het HLA-systeem is uitgebreid polymorfisch. De polymorfe aard van HLA-allelen werd aanvankelijk gevonden en gedefinieerd door serologische werkwijzen en de HLA-antigenen werden getallen gegeven. Later werd gevonden dat antigenen met dezelfde serologische specificiteit verschillende aminozuursequenties kunnen hebben. Tegen 1999 was het aantal bekende HLA-allelen meer dan 1000 en het aantal neemt nog steeds toe. Vanwege het uitgebreide polymorfisme is de nomenclatuur van de HLA-allelen complex en is het ook moeilijk voor een persoon om de nomenclatuur te begrijpen, tenzij de persoon zich op het gebied van histocompatibiliteit bevindt.

De eerste allelen met sequentie werden toegewezen aan namen met twee cijfers die overeenkwamen met hun serologische specificiteit. De eerste twee cijfers worden gevolgd door nog eens twee cijfers die de chronologische volgorde aangeven van naamgeving door het WHO-comité voor de nomenclatuur voor factoren van het HLA-systeem. (Bijvoorbeeld: het eerste allel waarvan de sequentie afkomstig was van een HLA-A2-gen werd HLA-A 0201 genoemd en de tweede gesequenseerde allel werd HLA-A 0202 genoemd.)

HLA-typering gebeurt door serologische typewerkwijzen of moleculaire typeringsmethoden. De serologische HLA-typeringsmethoden detecteren de epitopen van de HLA-moleculen, terwijl de moleculaire werkwijzen de nucleotidensequenties detecteren.

ik. HLA-typering die groepen allelen definieert (meestal benaderende serologische specificiteiten) wordt lage resolutie of generieke typering genoemd (bijvoorbeeld HLA-DRBl-04).

ii. Typen waarmee alle bekende allelen zijn opgelost, wordt HLA-typering met hoge resolutie genoemd (bijvoorbeeld HLA-DR BI x401).

iii. Typering die verder gaat dan serologische specificiteiten, maar waarbij het allelniveau niet wordt bereikt, wordt aangeduid als tussentijdse -resolutie-typering (bijvoorbeeld HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Het National Marrow Donor-programma heeft code gecreëerd om het beheer van deze complexe gegevens met gemiddelde resolutie te vergemakkelijken. In dit systeem is de naam voor HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.

Histocompatibiliteitstests volgens serologische methoden:

Lymfocyten worden gebruikt voor serologische HLA-typering, antilichaamscreening en kruismatching.

Isolatie van lymfocyten voor HLA-typering:

ik. Perifeer veneus bloed wordt gemengd met Ficoll-Hypaque en gecentrifugeerd. De laag die mononucleaire cellen uit perifeer bloed bevat, wordt afgezogen, gewassen en gebruikt.

ii. Lymfocyten geïsoleerd uit de lymfeknopen en de milt van kadavers worden gebruikt.

iii. HLA-typering voor klasse II-antigenen gebeurt met verrijkte B-celpopulaties (ongeveer 80% van normale perifere bloed-T-cellen zijn rustende T-cellen die klasse II-antigenen op hun oppervlak missen).

iv. Anti-CD2 of anti-CD3 mAbs gecoate magnetische parels worden gebruikt om T-cellen te isoleren; en anti-CD19 mAbs gecoate magnetische korrels worden gebruikt om B-cellen te isoleren.

Detectie van HLA-antigenen van lymfocyten:

Micro cytotoxiciteitstest is een complement-afhankelijke lymfecytotoxiciteitstest. Bevroren bordjes voor het typen die putjes bevatten bekleed met verschillende antilichamen tegen HLA-antigenen zijn in de handel verkrijgbaar.

Ongeveer 2000 lymfocyten worden in elk putje van de schaal gedispergeerd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. (Antilichamen in elk putje binden aan specifieke HLA-antigenen op het oppervlak van lymfocyten, indien aanwezig.)

↓

Vijf μl-complement (gewoonlijk konijnenserum) wordt aan elk putje toegevoegd en gedurende 60 minuten geïncubeerd (complement-eiwitten veroorzaken de dood van lymfocyten die zijn bekleed met mAbs.) Bij afwezigheid van mAb-binding met lymfocyten wordt het complement niet geactiveerd en de lymfocyten worden niet gedood).

↓

De kleurstof eosine Y, gevolgd door formaldehyde (formaldehyde fixeert de reactie) wordt toegevoegd.

↓

Vervolgens worden de dode cellen en levende cellen in elk putje geteld onder een fasecontrastmicroscoop.

ik. Gezwollen en donkere cellen zijn dode cellen (de kleurstof eosine Y komt in de dode cellen terecht).

ii. Heldere en refractiele cellen zijn levende cellen (de kleurstof eosine Y komt niet in levende cellen binnen).

Elke well in de lade wordt afzonderlijk bekeken voor dode cellen en levende cellen. Het percentage dode cellen in elk putje wordt berekend en de score wordt uitgevoerd volgens tabel 27.5.

Tabel 27.5: Scoring van de lymfecytotoxiciteitstest voor HLA:

Het HLA-type van een individu wordt bepaald door interpretatie van de reactie van de lymfocyten van het individu met verschillende antisera die worden gebruikt in de complementafhankelijke lymfecytotoxiciteitstest.

ik. Van elk individu wordt verwacht dat het twee HLA-A-, twee HLA-B- en twee HLA-C-antigenen op het oppervlak van lymfocyten heeft.

ii. Als een individu bij de test slechts één HLA-A- of HLA-B- of HLA-C-antigenen vertoont, is die persoon waarschijnlijk homozygoot voor dat specifieke antigeen of heeft het panel van antisera dat in de test wordt gebruikt, niet het specifieke antilichaam tegen de tweede antigeen of er is lage expressie van HLA-moleculen op het lymfocytoppervlak.

De complement-afhankelijke lymfcytotoxiciteitstest voor HLA-DR- en HLA-DQ-antigenen wordt uitgevoerd door gebruik te maken van B-cellen die zijn geïsoleerd door mABs beklede magnetische kralen of B-cellen geïsoleerd over nylonwol.

De meeste HLA-typeringssera worden verkregen van multiparous vrouwen. Omdat de mutioparous vrouwen herhaaldelijk worden blootgesteld aan de HLA-antigenen van de foetussen, hebben de sera van de multiparae vrouwen antilichamen tegen HLA-antigenen. Bijna 200 verschillende antisera worden gebruikt om de HLA-antigenen van een individu te typen.

Aanvankelijk werd gedacht dat mAbs voor elk van het HLA-antigeen konden worden ontwikkeld en de HLA-typering eenvoudig zou zijn. Maar veel mAb's binden eerder aan de algemene epitopen dan aan de private epitopen van de HLA-antigenen. Bovendien maken veel mAb's van muis geen complement vast (en daarom is het gebruik ervan in complement-afhankelijke lymfecytotoxiciteitstesten beperkt).

Muizen mAbs kunnen echter worden gebruikt bij de ELISA-methode en de flowcytometriewerkwijze, die geen complement vereisen. De laatste tijd geven veel laboratoria de voorkeur aan moleculaire HLA-typering in plaats van serologische HLA-typering.

Screening van het serum van de ontvanger van de transplantaat op antilichamen tegen l-ILA-antigenen (screening op antilichamen):

De aanwezigheid van antilichamen tegen HLA-antigenen in het serum van een ontvanger van een wachtend orgaantransplantaat wordt gewoonlijk gedaan door complement-afhankelijke lymfecytotoxiciteit. Lymfocyten met bekende HLA-antigenen en complement worden gemengd met het serum van de ontvanger. Na geschikte incubatie worden de dode lymfocyten en levende lymfocyten geteld. Het percentage paneelreactief antilichaam (PRA) wordt vervolgens berekend.

PRA = aantal positieve cellen / aantal totale paneelcellen x 100

PRA geeft de mate van sensibilisatie van de wachtende ontvanger aan HLA-antigenen aan.

ELISA-methode voor screenen van serume HLA-antilichamen:

De ELISA-methode is eenvoudig, snel en vereist geen levende lymfocyten en aanvulling. Affiniteitgezuiverde HLA-antigenen worden gecoat op de wanden van de microtiterplaat

↓

Het serum van de ontvanger wordt toegevoegd en geïncubeerd

↓

Na het wassen wordt aan enzym geconjugeerd anti-humaan IgG toegevoegd en geïncubeerd.

↓

Na het wassen wordt substraat toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Ontwikkeling van kleur in een bepaald putje geeft de aanwezigheid aan van IgG-antilichamen tegen het HLA-antigeen gecoat op dat specifieke putje.

ii. Niet-ontwikkeling van kleur in een bepaalde put geeft de afwezigheid van antilichamen tegen het bepaalde HLA-antigeen dat in die put is gecoat, aan.

Flowcytometer voor detectie van serum HLA-antilichamen:

Microkorrels gecoat met HLA-antigenen worden geïncubeerd met het serum van de patiënt en vervolgens met fluorescerende gemerkte anti-humane IgG-antilichamen. Het percentage parels dat kleurt boven de achtergrond, geeft de maat van het percentage paneelreactieve antilichamen van de patiënt (PRA).

Cross Matching:

Als het bloed van een wachtende ontvanger antilichamen tegen de donor-HLA-antigenen bevat, zullen de HLA-antigenen op de donorcellen worden aangevallen door de antilichamen van de ontvanger, na transplantatie. Daarom is het voor transplantatie van essentieel belang om te weten of de ontvanger antilichamen heeft tegen de donor-HLA-antigenen.

Als donor-HLA-antigeen-specifieke antilichamen in het serum van de ontvanger aanwezig zijn, wordt het transplantaat afgewezen. Cross-matching wordt uitgevoerd om de aanwezigheid van serumantistoffen van wachtende ontvanger tegen de voorgestelde donor-HLA-antigenen te detecteren.

Lymfcytotoxiciteit Cross Matching met perifere bloedlymfocyten:

Perifere bloedlymfocyten van de voorgestelde donor (die ongeveer 80 procent T-cellen bevat (die MHC klasse I-antigenen dragen) en 20 procent B-cellen en monocyten (die MHC klasse I en klasse II antigenen dragen) worden gemengd met het serum van de wachtende ontvanger en geïncubeerd .

↓

Complement wordt toegevoegd en geïncubeerd.

↓

De kleurstof eosine Y wordt toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Het aantal dode en levende cellen wordt geteld en het percentage dode cellen wordt berekend. 50 procent of meer celdood duidt op een sterke positieve kruisovereenkomst (dwz het serum van de ontvanger heeft antilichamen die in staat zijn te reageren met donor-HLA-antigenen). Een sterke positieve kruisbestuiving tussen een ontvanger en een voorgestelde donor is een contra-indicatie voor orgaantransplantatie van de donor naar de ontvanger.

Om te bepalen of de antistoffen van de ontvanger zijn gericht tegen de klasse I- of klasse II-antigenen, worden T-cel-lymfecytotoxiciteitskruisvergelijking (met behulp van verrijkte T-cellen) of B-cel-lymfecytotoxiciteit cross-matching (met behulp van verrijkte B-cellen) uitgevoerd.

Flowcytometer cross-matching is 30-250 keer gevoeliger dan de visuele serologische methoden voor de detectie van IgG-antilichamen tegen HLA-antigenen op het oppervlak van lymfocyten.

Perifere bloedlymfocyten van de voorgestelde donor worden geïncubeerd met gemerkte (bijvoorbeeld een fluorescente kleurstof die groen licht uitzendt) anti-CD3 mAbs, die binden aan T-cellen.

↓

De gelabelde aan ani-CD3 gebonden T-cellen worden in de flowcytometer van B-cellen gescheiden.

↓

De gescheiden, gekleurde T-cellen worden nu geïncubeerd met het serum van de wachtende ontvanger.

ik. Serumantilichamen van de ontvanger tegen de H-antigenen van de T-cel van de donor, indien aanwezig, zullen aan de T-cellen binden.

↓

Na het wassen wordt een flurochroom (dat een kleur uitzendt, anders dan groen, zegt rode kleur) gelabeld anti-humaan IgG toegevoegd en geïncubeerd.

ii. Het met florochroom gemerkte anti-humane IgG zal binden aan de HLA-antilichamen van de ontvanger, die zijn gebonden aan de donor-T-cellen.

De flowcytometer telt het aantal T-cellen (rode en groene kleur) en T-cellen (groene kleur) en maakt een histogram.

Cross-matching voor auto-antilichamen tegen lymfocyten:

Tijdens een cross-match kunnen auto-antilichamen tegen lymfocyten in het serum van de ontvanger niet-specifiek binden aan de donorlymfocyten en een vals-positief kruis-resultaat geven; en bijgevolg wordt de donor ten onrechte gediskwalificeerd voor het doneren van een orgaan aan de betreffende ontvanger. Auto-antilichamen kunnen ook de aanwezigheid van specifieke anti-donor antilichamen maskeren.

De aanwezigheid van auto-antilichamen tegen lymfocyten wordt gedetecteerd door de auto-kruismatch, waarbij de eigen lymfocyten en serum van de ontvanger worden gecombineerd in een standaard cytotoxiciteitstest. Auto-antilichaam-kruisovereenkomsten worden routinematig uitgevoerd in combinatie met alle cross-matches van levende donoren voor elk serum dat wordt getest.

Moleculaire biologiemethoden voor HLA-typering:

De meeste van de moleculaire typeringsmethoden maken gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) -techniek om op selectieve wijze de voor het typen vereiste HLA-gensegmenten te amplificeren.

Sequence-specifieke Priming (SSP) Typing:

DNA van het individu wordt geëxtraheerd uit cellen of weefsels

↓

DNA wordt toegevoegd aan buizen die verschillende primersets bevatten voor verschillende HLA-genen. Een extra reeks primers is opgenomen als een positieve controle van amplificatie in alle buizen.

`↓

De andere componenten van de PCR-reactie (zoals DNA-nucleotiden, DNA-polymerase, buffer) worden toegevoegd en de thermische cycli worden uitgevoerd.

↓

De geamplificeerde producten worden geëlektroforeerd in gel met ethidiumbromide en gefotografeerd onder UV-licht.

ik. Aanwezigheid van band geeft aan dat het DNA-monster de sequentie heeft die overeenkomt met het specifieke HLA-type.

ii. Afwezigheid van band geeft aan dat het DNA-monster niet de specifieke sequentie van het HLA-type bevat.

iii. De interne amplificatiecontroleband moet aanwezig zijn voor interpretatie.

Sets van primers voor HLA-typering zijn in de handel verkrijgbaar.

ik. Voor HLA-A-, B- en C-typering zijn ongeveer 100-200 reacties vereist.

ii. Voor HLA-DRB-typering zijn ongeveer 20-30 reacties vereist.

Sequentiespecifieke oligonucleotide probehybridisatie (SSOP):

SSOP-werkwijze omvat de selectieve amplificatie van het HLA-doelwit gevolgd door hybridisatie met een panel van oligonucleotideprobes. Er zijn twee SSOP-indelingen.

ik. Dot of slot blot:

Het geamplificeerde DNA is gebonden aan de vaste drager (zoals een nylon membraan) en de hybridisatieprobe is in oplossing.

ii. Omgekeerde punt of slot blot:

De probe wordt gebonden aan de vaste drager en gehybridiseerd aan het geamplificeerde DNA in oplossing.