DNA-replicatie is semi-conservatief - (experimenteel bewijs)

Enkele van de belangrijkste experimentele bewijzen dat DNA-replicatie semi-conservatief is, zijn ze als volgt: 1. Meselson en Stahl experiment 2. Taylor's experiment.

1. Meselson en Stahl-experiment:

Experiment uitgevoerd door Mathew Messelson en Franklin Stahl (1957-58) hebben overtuigend aangetoond dat in intact levende E. coli-cellen dat DNA op semi-conservatieve wijze wordt gerepliceerd zoals gepostuleerd door Watson en Crick.

Messelson en Stahl (1958) gekweekte bacteriën E. coli in een cultureel medium dat 15N isotopen ¹⁵ NH4C1 ( ¹⁵ N is isotoop stikstof) van stikstof bevat. Na de replicatie van DNA van E. coli gedurende vele generaties in ¹⁵ N medium, werd gevonden dat beide strengen DNA ¹⁵ N als bestanddeel van purinen en pyrimidinen bevatten.

Dit zware DNA-molecuul kon worden onderscheiden van het normale DNA door centrifugatie in een cesiumchloride (CsCl) dichtheidsgradiënt. Omdat ¹⁵ N geen isotoop met radio-isotopen is, kan het alleen worden gescheiden van ¹⁴ N op basis van dichtheden.

Toen deze bacteriën met geïncorporeerde ¹⁵ N in medium werden geplaatst dat ¹⁴ N ( ¹⁴ NH4C1) bevatte, werd opgemerkt dat nieuw gevormde DNA-moleculen één streng zwaarder bevatten dan de andere. Het DNA dat werd gevormd bleek hybride te zijn, omdat de ene streng was samengesteld uit '^ N (oud) en de andere bestond uit ¹⁴ N (nieuw) (figuur 6.22).

De verschillende monsters werden onafhankelijk gescheiden op CsCl-gradiënten om dichtheden van DNA na 20 minuten (1e generatie) te meten. De E.coli-bacterie splitst in 20 minuten. Tijdens de tweede replicatie (na 40 minuten) in normaal ¹⁴ N medium werden beide strengen weer gescheiden (met radioactief en niet-radioactief ¹⁵ N).

Er werd waargenomen dat van de totaal vier gevormde DNA-moleculen er twee volledig niet-radioactief waren en de resterende twee met een half radioactieve en een andere helft niet-radioactieve streng.

2. Taylor's experiment:

JH Taylor et. al. (1958) toonde ook de semi-conservatieve wijze van replicatie in DNA en chromosomen aan in worteltipcellen van Vicia faba. Na de opname van radioactief thymidine 3H werden de wortelpunten overgebracht op niet-gemerkt medium dat colchicine bevat.

Radioactieve chromosomen (met gelabeld DNA met ³ H) verschenen in de vorm van verspreide zwarte stippen van zilverkorrels. Na replicatie van DNA en de vorming van chromosomen werden volgende feiten opgemerkt (Fig. 6.23).

(a) In de eerste generatie werd gevonden dat de radioactiviteit uniform verdeeld was in beide chromosomen. In dergelijke gevallen werd de oorspronkelijke streng DNA-dubbele helix gemerkt met 3H en de nieuw gevormde streng was niet gemerkt.

(b) Tijdens de tweede deling vertegenwoordigde slechts een van de twee chromosomen de radioactiviteit door één streng radioactief (origineel) en een ander niet-radioactief (nieuw gevormd) te tonen.

Waarom werken beide strengen DNA niet als sjabloon voor RNA-synthese?

1. Beide strengen van DNA hebben een verschillende volgorde. Eiwitten die aldus worden gevormd, vanwege de aanwezigheid van verschillende aminozuren, zullen verschillen.

2. Door de vorming van twee verschillende eiwitten uit één DNA zal het genetische informatie- en overdrachtsmechanisme gecompliceerd worden.

3. Als twee strengen RNA tegelijkertijd uit één DNA-molecuul worden gevormd en complementair zijn, zal RNA dubbelstrengig worden. Het zal de translatiestap stoppen en eiwitvorming zal er niet zijn. De transcriptiestap zal dus niet van enig nut zijn voor eiwitsynthese.