Complementassays van antigenen en antilichamen
Complement Assays van antigenen en antilichamen!
Werkwijzen voor nauwkeurige bepaling van elk van de complementcomponenten van alle drie de complementactiveringsroutes en verschillende enzymen en regulatoren van het complementsysteem zijn beschikbaar.
Veel van de testen zijn echter alleen beschikbaar in onderzoekslaboratoria.
Er zijn twee soorten complementassays:
1. Testen die complement-eiwitten meten als antigenen.
2. Testen die de functionele activiteit van complement meten.
Testen die complement-eiwitten meten als antigenen zijn over het algemeen eenvoudig uit te voeren, goedkoop, minder tijdrovend en kunnen in veel laboratoria worden gedaan. Maar deze antigene testen verschaffen geen informatie over de functionele mogelijkheden van de complementcomponenten omdat deze complementantigeenassays zowel functioneel actieve complementcomponenten als de complementafbraakproducten detecteren.
ik. In het algemeen zijn antigene assays niet zo gevoelig als functionele testen.
ii. Antigene testen detecteren geen lage niveaus van complementcomponenten in bepaalde lichaamsvloeistoffen.
iii. ELISA-tests zijn beschikbaar voor het meten van gesplitste producten van complementcomponenten of complexen die tijdens complementactivatie worden gevormd.
iv. Complementactivatie via de klassieke route kan worden gemeten door de niveaus van C4d en C4 in het serum te volgen.
v. ELISA-meting van C1r-C1s-C1INH-complexen verschaft een maat voor complementactivering via de klassieke route.
vi. Activering van een alternatieve route kan worden gemeten met de ELISA-methode door de niveaus van Bb- of C3bBbP-complexen in omloop te beoordelen.
vii. Activering van een klassieke of alternatieve route kan worden gevolgd door het meten van de niveaus van iC3b of de oplosbare vorm van membraanaanvalcomplex sC5b6789.
viii. ELISA-kits voor het meten van de anafylotaxine C3a en C5a in serum of plasma zijn beschikbaar.
Monsterafhandeling voor complementbepalingen:
Een goede behandeling van monsters is van cruciaal belang voor functionele complementassays. Sommige van de complementcomponenten zijn zeer labiel.
ik. Voor de meeste functionele testen heeft serum de voorkeur boven plasma, omdat de calciumchelatoren (zoals EDTA, heparine) die worden gebruikt om plasma te verkrijgen, anti-complementair kunnen zijn.
ii. Voor functionele testen moet het bloed bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten stollen en vervolgens op ijs gedurende minstens een uur.
iii. Voor Clq-bindingsassays moet het bloed gedurende 2 uur bij kamertemperatuur stollen. Het stolsel wordt omrand en gedurende 5 minuten bij 0 ° C tot 4 ° C gecentrifugeerd. Als cryoprecipiterende antilichamen worden vermoed, moet stolselvorming en centrifugatie van het bloed worden uitgevoerd bij 37 ° C, omdat complementfixatie kan optreden als het monster wordt gekoeld.
iv. Serum- of plasmamonsters moeten worden verdeeld in meerdere kleine volumes en onmiddellijk worden bewaard bij 40 tot -80 ° C.
v. Wanneer sera worden overgebracht, moeten ze goed worden afgedicht en in containers met grote hoeveelheden droog ijs worden geplaatst.
Complement functionele testen:
De buffers die worden gebruikt in functionele complementassessies zijn essentieel omdat veranderingen in molariteit en metaalionenconcentraties de complementatietiterwaarden kunnen beïnvloeden. CH 50- assay voor klassieke complementroute: de eenvoudigste functionele test van de klassieke route meet het totale hemolytische complement.
De afwezigheid van elk van de complementcomponenten resulteert in een totale hemolytische complementatietiter (CHso) van nul. Schapenerytrocyten worden in het algemeen gebruikt als doelcellen voor het meten van de CHso of de functionele activiteit van geïsoleerde complementcomponenten. Schapen-RBC's zijn gevoeliger voor antilichaam- en complement-gemedieerde lysis dan de RBC's van andere soorten.
AH 50- assay voor alternatieve complementroute:
Konijnenerytrocyten worden gebruikt om AH 50 te meten. Konijnen-RBC's zijn gevoelig voor antilichaamonafhankelijke lysis die wordt gemedieerd door humaan serum.
ik. CH 50- en AH 50- assays zijn uitstekende screeningstesten om genetische deficiëntie van complementcomponenten uit te sluiten.
ii. Normale CH 50- activiteit met verlaagde AH 50- waarden is het gevolg van defecten in de alternatieve complementroute.
iii. Tekortkomingen in de terminale complementcomponenten leiden tot verlies van zowel CH 50- als AH 50- activiteiten.
iv. Homozygote deficiëntie van een complementcomponent heft de hemolytische assay volledig op.
De mate van hemolyse wordt beïnvloed door vele factoren, zoals de erytrocytenconcentratie, fragiliteit (leeftijd) van de erythrocyten, hoeveelheid antilichaam die wordt gebruikt voor sensibilisatie, aard van het antilichaam (IgG of IgM), ionsterkte van het buffersysteem, PH, reactietijd, temperatuur en calcium 2+ of magnesium 2+ concentraties. De waarde voor CH50-eenheden in menselijk serum wordt op verschillende manieren berekend, zoals de Von-krough-vergelijking.
Meting van functionele tekortkomingen van individuele complementcomponenten:
Wanneer de geschiedenis en symptomen van een patiënt een mogelijke complementcomponentdeficiëntie suggereren, kunnen hemolytische titraties van individuele componenten vereist zijn. Om lyses van erythrocyten te produceren, zijn aanwezigheid en activering van de volledige complementcomponenten (C1 - C9) nodig. Als een van de componenten afwezig is, vindt hemolyse niet plaats. Zuivere preparaten van elk van de individuele complementcomponenten zijn nodig om de afwezigheid van een bepaalde complementcomponent in het serum of plasma van een patiënt te detecteren.
Voor het meten van individuele complementcomponenten zijn gedeeltelijk gezuiverde componenten vereist. Het meten van C4 is echter een uitzondering, vanwege de beschikbaarheid van C4-deficiënt (C4D) serum van cavia's. Sera van C2-deficiënte mensen en cavia's en C6-deficiënte konijnen zijn verkrijgbaar in enkele laboratoria.
Functionele complementassays van individuele componenten zijn gevoelig en bieden accurate informatie over de activiteit van een complementcomponent. Maar de meeste van deze testen zijn beperkt tot onderzoekslaboratoria.
Meting van individuele complementcomponent door antigeenanalyse:
Enkelvoudige radiale immuun-diffusie is de meest gebruikelijke methode voor het kwantificeren van complementcomponenten, zoals C3, C4 en factor B. Er dient aan te worden herinnerd dat alle functionele complementassays kunnen worden geremd door anti-complementaire werking van serum (dat kan resulteren uit antigeen- antilichaamcomplexen, heparine, chelaatvormende middelen en geaggregeerde immunoglobulinen).
Aanvulling Fixatietest:
Wanneer er interactie tussen antigeen en antilichaam is, worden de complementcomponenten geactiveerd en geconsumeerd. Vandaar dat in-vitro-testconsumptie van complement de aanwezigheid van antigeen-antilichaaminteractie aangeeft. Dit principe wordt gebruikt voor het detecteren en meten van antigeen of antilichamen in de complementbindingsreactie.
De test wordt in twee fasen uitgevoerd. In de eerste fase vindt antigeen-antilichaaminteractie plaats en wordt het complement verbruikt. In de tweede fase wordt een indicatorsysteem gebruikt om te detecteren of complement al dan niet wordt verbruikt in de eerste fase reactie.
ik. Als het complement wordt verbruikt in de eerste fase, betekent dit dat antigeen-antilichaamreactie is opgetreden in de eerste fase.
ii. Als complement niet wordt geconsumeerd, betekent dit dat er geen antigeen-antilichaaminteractie was in de eerste fase.
Detectie van antilichaam door complementfixatietest:
Eerste fase:
Vaste concentraties van bekend antigeen en complement (gewoonlijk vers cavia-serum wordt gebruikt als een bron van complement) worden genomen. Het serum dat (onbekende antilichamen) bevat, wordt toegevoegd en geïncubeerd.
A. Bekend antigeen + complement + serum (overeenkomstige antilichamen aanwezig). Het complement wordt verbruikt tijdens de incubatie.
B. Bekend antigeen + complement-1-serum (corresponderende antilichamen afwezig). Het complement wordt niet geconsumeerd omdat het serum geen antilichamen bevat die specifiek zijn voor het bekende antigeen.
Tweede podium:
Schapenerytrocyten bekleed met antilichamen tegen konijnen van konijn tegen erytrocyten worden aan de buizen toegevoegd. In aanwezigheid van complement zullen de schapenerytrocyten worden gelyseerd (hemolyse). In afwezigheid van complement lyseren de erythrocyten niet (geen hemolyse).
A. Omdat het complement wordt gebruikt tijdens de reactie in de eerste fase, worden de met antilichaam gecoate schapenerythrocyten niet gelyseerd. Daarom suggereert de afwezigheid van hemolyse dat het serum specifieke antilichamen tegen het in de test gebruikte antigeen bevat.
B. Omdat het complement niet wordt gebruikt in de eerste fase, worden de met antilichaam gecoate schapenerytrocyten gemhemolyseerd door het complement in de tweede fase. Daarom suggereert de aanwezigheid van hemolyse dat het serum geen specifieke antilichamen tegen het gebruikte antigeen bevat.
Complementfixatietests worden veel gebruikt in klinische laboratoria en onderzoek. Virussen, serumantistoffen tegen virale infecties, antilichamen tegen Treponema pallidum die syfilis, antischimmelantilichamen (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), anti-Mycoplasma pneumoniae-antilichamen en anti-rachitisantilichamen veroorzaken, worden gedetecteerd door complementfixatietest.
