Top 3 opeenvolgende stappen van polymerasekettingreactie (PCR)

De volgende punten markeren de drie belangrijkste opeenvolgende stappen van polymerasekettingreactie (PCR). De opeenvolgende stappen zijn: Denaturing 2. Gloeien 3. Uitbreiding van DNA.

Opeenvolgende stap # 1. Denaturering:

De eerste stap is om het DNA te denatureren (zowel Primer DNA als Native DNA). Scheiding van twee DNA-strengen staat bekend als denatureren, terwijl het samenbrengen van twee stands als re-annealing of hybridisatie wordt genoemd (figuur 48.1). De ontdekking van het denatureren en opnieuw uitgloeien van DNA werd kunstmatig gemaakt door Marmor en Lane (1960).

Volgens hen zou het dubbelstrengs DNA kunnen worden gescheiden in twee afzonderlijke enkele strengen (denatureren) door verhitting op hoge temperatuur (90-95 ° C) en hybridisatie of verbinding van twee DNA-strengen (dubbelstrengs DNA) die mogelijk is door verlaging van de temperatuur (50-56 ° C).

Dit is het hoofdprincipe waarop de PCR functioneert. Het tweede principe is uitbreiding van de primer met behulp van DNA-polymerase-enzym.

Het natieve DNA, primer en DNA-polymerase-enzym (Tag-polymerase) worden in een PCR-buis toegevoegd en de temperatuur wordt verhoogd en verlaagd in de PCR-machine om te denatureren en te hybridiseren.

Opeenvolgende stap # 2. Gloeien:

Na het denatureren van het DNA, is de volgende stap om toe te staan ​​dat de synthese-primer wordt gekoppeld aan de tegenovergestelde DNA-strengen van de gewenste doelwitsequentie. Gloeien (hybridisatie) kan optreden als de temperatuur vanaf 95 ° C wordt verlaagd tot 50/56 ° C. De temperatuur wordt vervolgens in de machine verlaagd.

Zodra de temperatuur verlaagd is, zullen de natieve DNA-strengen niet alleen aan elkaar binden maar ook de primers binden. Deze specifieke hybridisatie, of "recombinatie" van complementaire nucleotiden, verschaft zowel redenering als de praktische basis voor veel van recombinant DNA (figuur 48.2).

Opeenvolgende stap # 3. Uitbreiding van DNA (Taq Polymerase Enzyme is nodig):

Nadat de primers zijn uitgegloeid, moeten ze worden verlengd met behulp van de oligonucleotide primer als beginpunt. beschreven dat enzym-DNA-polymerase noodzakelijk is voor de synthese van DNA. Daarom hebben we voor de verlenging van de primer een thermostabiel DNA-polymerase nodig, zodat het enzym niet bij hoge temperatuur wordt vernietigd.

Het thermostabiele polymerase (Taq-polymerase) wordt geïsoleerd uit Thermus aquaticus. Het Taq-polymerase heeft een enorm voordeel bij het uitvoeren van de PCR-reactie. Het heeft een optimale activiteitstemperatuur van ongeveer 70 ° C en vers enzym hoeft niet te worden toegevoegd aan elke reageerbuis na het verwarmings- en koelproces.

Thermo-stabiel DNA-polymerase wordt nu vervaardigd door verschillende bedrijven met verschillende bronnen (behalve Thermus aquaticus) onder verschillende handelsnamen (TM). Voor de verlenging van de primer wordt het thermostabiele DNA-polymerase in de buis toegevoegd en de temperatuur wordt vervolgens verhoogd tot 65-70 ° C.

Daaropvolgende cycli van strengscheiding (denaturatie), primerhybridisatie (annealing) en strengsynthese (extensie) zorgen voor exponentiële amplificatie van de doelsequenties door gebruik te maken van de geamplificeerde sequentie als de vorige cyclus als een nieuwe sjabloon, er drie cycli zijn (figuur 48.2). ).

Primer Maken:

De primers zijn van een korte sequentie (vaak RNA) die wordt gebruikt om twee nucleotiden te maken, aangeduid als primer, met één voor elk uiteinde van het DNA-fragment en verschaft een vrij 3-OH-uiteinde waarbij een DNA-polymerase de synthese start van een deoxyribonucleotide-keten.

Eén reeks wordt gemaakt in de richting van de richting, terwijl de andere wordt gemaakt in de antisense richting. (Afb. 48.2). De primer wordt gebruikt om de synthese van complementaire DNA-strengen te primen en zodanig ontworpen dat het DNA tussen de primers het fragment is dat van belang is om te worden geamplificeerd.

Als het boodschapper-RNA (mRNA) wordt geamplificeerd, moet het worden omgezet in complementair DNA (cDNA) door een RNA-afhankelijk DNA-polymerase, reverse transcriptase. Het cDNA-complex wordt vervolgens veranderd in dubbelstrengig DNA en wordt een matrijs voor een daaropvolgende PCR-reactie.

Dit staat vaak bekend als reversed transcriptase polymerase chain reaction (RT PCR). De primers kunnen kunstmatig worden gegenereerd of kunnen bij de bedrijven worden gekocht.

Nadat de reactie is voltooid, kunnen de geamplificeerde producten (DNA) worden gevisualiseerd door middel van gelelektroforese. De belangrijke fysische eigenschap van het DNA-molecuul is dat elk afzonderlijk nucleotide een netto negatieve lading heeft die voortkomt uit de fosfaatgroep.

Dus fragmenten van verschillende grootte blootgesteld aan een elektrisch veld hebben de neiging om te migreren naar de positieve elektrode met verschillende snelheden afhankelijk van de grootte, waarbij kleine fragmenten sneller migreren dan de grotere. Dit proces van op scheiding gebaseerde elektrische lading wordt elektroforese genoemd.

De DNA-monsters worden, nadat zij door een restrictie-enzym (endonuclease) in fragmenten van verschillende grootten zijn gedigereerd, toegevoegd aan dragermedium zoals agrose-gel of acrylamide. De poriën van de gel zijn afhankelijk van het percentage en kunnen worden vergeleken met een (moleculaire) zeef. Aldus hangt de migratiesnelheid van de DNA-fragmenten door gel af van zowel de grootte van het DNA-fragment als de toegepaste spanning.

De procedure voor het scheiden en aftrekken van specifiek DNA-fragment is Southern-blotting. Het belang van deze techniek is dat fragment van een enkele streng kan worden overgedragen door capillaire werking naar een vast dragermedium (nylon of cellulosemembraan) en permanent kan worden gefixeerd door verwarming (figuur 48.3).

Na elektroforese kan het patroon van DNA worden gevisualiseerd onder een UV-lamp na behandeling met ethidiumbromidekleuring; het ethidiumbromide is een fluorescente kleurstof. De agro-gelelektroforese onderscheidde fragmenten van 100 basenparen tot 60000 basenparen (60 kb) terwijl polyacrylamidegelen effectief fragmenten scheiden dan 1000 basenparen (1 kb).

Pulsgelelektroforese (PFGE) heeft de scheiding van DNA-fragmenten zelfs tot 2 kb mogelijk gemaakt. In deze procedure wordt het elektrische veld in verschillende richtingen gewijzigd waardoor de DNA-moleculen gedwongen worden om zich opnieuw te oriënteren tussen elke puls of elektrische stroom. Dit is de beste techniek om een ​​bekend gen te identificeren.

De endonucleasen kunnen 3, 4, 5, 6 of 8 basenparen herkennen en zijn verkrijgbaar in de markt.

PCR-buffers / zouten.

Voor Taq DNA-polymerase wordt de buffer gemaakt zoals hieronder:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCl bij kamertemperatuur

Dimethylsulfoxide (DMSO) en glycol worden gebruikt als co-oplosmiddel in PCR-buffers wanneer het doelwit een zeer hoge denaturatietemperatuur heeft.

Deoxynucleotide-trifosfaat (dNTP's) is ioncofactoren.

Nu leveren biotechnologische bedrijven geprepareerde oplossingen.

Het basisprincipe wordt als volgt beschreven:

Er zijn vier dNTP's, namelijk dATP (adeninetrifosfaat), dCTP (cytosine), dGTP (gunine), dUTP (uracil) die volgens de basenpaarregels worden gebruikt om de primer uit te breiden en uiteindelijk de doelsequentie te kopiëren.

Het dNTP bindt met Mg ²⁺ . De hoeveelheid dNTP's die aanwezig is in een reactie, bepaalt de hoeveelheid vrij Mg2 ^{+ die} beschikbaar is voor optimale enzymactiviteit. Voorraad dNTP-oplossingen moeten worden geneutraliseerd met Tris-base tot pH 7, 0 en hun concentratie moet spectrofotometrisch worden bepaald.

Substraat en substraatanalogen:

Taq-polymerase werkt (dNTP) zeer effectief. Er zijn echter enkele gemodificeerde substraten beschikbaar in plaats van Tag DNA-polymerasesubstraat. Het zijn dogoxigenine dNTP, biotine-11-dUTP, C7deaza-dGTP en fluorescent gelabeld dNTPS.

De volgende soorten PCR worden algemeen gebruikt:

(1) Geneste PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Anker-PCR;

(4) Asymmetrische PCR;

(5) inverse PCR;

(6) DOP-PCR.