DNA-replicatie: mechanismen van DNA-replicatie

Enkele van de belangrijkste manieren van DNA-replicatie zijn als volgt!

DNA-replicatie in eukaryoten is semiconservatief, semi-discontinu en bidirectioneel in vergelijking met semiconservatief, bidirectioneel en continu in prokaryoten.

Afbeelding Courtesy: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

DNA-replicatie vindt plaats tijdens de S-fase van de celcyclus. Het is een meervoudig complex proces dat meer dan een dozijn enzymen en eiwitfactoren vereist. Het begint op een bepaalde plek genaamd origin of replication of ori. Bacterieel en viraal DNA heeft een enkele oorsprong van replicatie. Het functioneert als een enkele replicerende eenheid of replicon.

In eukaryoot DNA zijn er een aantal replicatieoorsprongen. Het heeft verschillende replicerende segmenten of replicons, dwz multirepliconic. Bij afwezigheid van ori zal replicatie niet optreden. De vereiste van een vector voor recombinant DNA-technologie is het verkrijgen van de oorsprong van replicatie.

Replicatie van DNA is energetisch zeer duur. Het belangrijkste enzym van DNA-replicatie is DNA-afhankelijk DNA-polymerase. DNA-replicatie is vrij snel. De replicatie van DNA van E. coli met 4, 6 x 106 bp vereist 19 minuten.

Op een gemiddelde snelheid van polymerisatie van basen is 2000 bp per seconde in elke richting. Replicatie vereist overvloedige energie die afkomstig is van afbraak van trifosfaten van deoxyribonucleotiden.

Replicatie vindt als volgt plaats:

1. Activatie van deoxyribonucleotiden:

Deoxyribonucleotiden of deoxyribonucleoside-monofosfaten komen vrij in het nucleoplasma voor. Ze zijn van vier typen: deAMP (deoxyadenosine monofosfaat), deGMP (deoxyguanosine monofosfaat), deCMP (deoxycytidine monofosfaat) en deTMP (deoxythymidine monofosfaat). Ze worden eerst gefosforyleerd en veranderd in actieve vormen die in plaats van één drie fosfaatresten bevatten. Enzymen fosforylase is vereist samen met energie.

De gefosforyleerde nucleotiden zijn deATP (deoxyadenosinetrifosfaat), deGTP (deoxyguanosinetrifosfaat), deCTP (deoxycytidine-trifosfaat) en deTTP (deoxythymidine-trifosfaat). Deze trifosfaten van basen dienen tweevoudig doel. Ze werken als substraat en leveren energie voor de polymerisatie van nucleotiden.

2. Blootstelling van DNA-strengen:

Enzymhelicase (unwindase) werkt op de Ori-site en ritst de twee strengen DNA open (afwindt) door waterstofbruggen te vernietigen. De gescheiden strengen worden gestabiliseerd door middel van enkelstrengige bindingseiwitten (SS BP's) of helix stabiliserende eiwitten. Afwikkelen creëert spanning in het niet-opgerolde deel door meer supercoils te vormen. De spanning wordt vrijgegeven door enzymen topoisomerases.

Ze veroorzaken het inkerven van en het hersluiten van de DNA-streng. Samen met topoisomerase bezitten bacteriën een ander enzym genaamd DNA-gyrase dat negatieve supercoils kan introduceren (oudere werknemers geloofden dat gyrase zowel voor helicase als voor topoisomerase functioneerde).

Met behulp van verschillende enzymen worden beide strengen van DNA open voor replicatie. Het hele DNA wordt echter niet in één keer geopend vanwege de zeer hoge energiebehoefte. Het punt van scheiding verloopt langzaam in beide richtingen. In elke richting geeft het de vorm van een Y-vormige structuur die de replicatievork wordt genoemd (afb. 6.13 en 6.14).

3. RNA-primer:

Het is essentieel voor de initiatie van nieuwe DNA-ketens. RNA-primer is een kleine streng RNA die wordt gesynthetiseerd aan het 5'-uiteinde van nieuwe DNA-streng met behulp van DNA-specifiek RNA-polymerase-enzym dat primase wordt genoemd. RNA-primer wordt gevormd op het vrije uiteinde van één streng en vorkuiteinde van de andere streng. Vorming van RNA-primer vormt de initiatiefase van DNA-synthese omdat zonder de aanwezigheid van RNA-primer, DNA-polymerasen geen nucleotiden kunnen toevoegen.

Een meer complex enzym dat primo wordt genoemd, is een beetje nodig in faag x 174 en enkele andere prokaryotische systemen. In eukaryoten wordt de functie van primase uitgevoerd door enzym DNA-polymerase α. Het bouwt ~ 10 basis-RNA en 20-30 basen van DNA op (Lewin, 2004). Na het begin van de nucleotide-keten wordt de RNA-primer verwijderd en de opening wordt gevuld door DNA-polymerase I in prokaryoten en DNA-polymerase β in eukaryoten.

4. DNA-polymerasen:

Prokaryoten hebben drie hoofdtypes van DNA-synthetiserende enzymen die DNA-polymerasen III, II en I worden genoemd. Allemaal voegen ze nucleotiden toe in 5 '-> 3'-richting op een 3'-> 5'-strook van de ouderstreng. Ze bezitten ook 3 '-> 5' exo-nucleaseactiviteit. Hoewel DNA-polymerase III voornamelijk betrokken is bij DNA-replicatie (additie en polymerisatie van nieuwe basen), is polymerase I een groot herstel-enzym. Polymerase II is een klein reparatie-enzym.

DNA-polymerase I heeft ook 5 -> 3 exonuclease-activiteit. In eukaryoten worden vijf typen DNA-polymerasen gevonden - α, β, γ, δ en ε, maar de belangrijkste drie zijn α, δ en e. Polymerase 8 is betrokken bij replicatie van leidende streng. Polymerase kan helpen bij de synthese van achterblijvende streng samen met andere rollen. Polymerase α is het grootste en belangrijkste enzym voor replicatie van DNA. Alle DNA-polymerasen hebben een configuratie van een grijphand met duim aan de ene kant, vingers aan de andere en de palmachtige holle katalytische plaats voor het combineren van sjabloon- en basenparen.

5. Base-koppeling:

De twee gescheiden DNA-strengen in de replicatievork fungeren als sjablonen. Deoxyribonucleoside-trifosfaten komen tegenover de stikstofbasen van blootgestelde DNA-templates te liggen - deTTP tegenover A, deCTP tegenover G, deATP tegenover T en deGTP tegenover C.

Nucleofiele aanval scheidt een pyrofosfaat (PPi) van het trifosfaat. Fosfodiester-koppelingen worden vastgesteld. Hydrolyse van pyrofosfaat door enzympyrofosfatase geeft energie vrij. Deoxyribouncleoside trifosfaat → Deoxyribouncleoside monophosphate + PPi

De energie wordt gebruikt bij het tot stand brengen van waterstofbruggen tussen de vrije nucleotiden en stikstofbasen van sjablonen.

6. Kettingvorming:

Het vereist DNA-polymerase III (Kornberg, 1956) in prokaryoten en polymerase 8 / s in eukaryoten. DNA-polymerase III is een complex enzym met zeven subeenheden (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). In aanwezigheid van Mg2 ⁺, ATP (GTP), TPP en DNA-polymerase III stellen de aangrenzende nucleotiden die zijn gehecht aan stikstofbasen van elke matrijs-DNA-streng fosfodiesterbindingen vast en worden gekoppeld aan de vorm van een gerepliceerde DNA-streng.

Naarmate de replicatie voortschrijdt, worden nieuwe gebieden van de oorspronkelijke DNA-duplex afgewikkeld en gescheiden, zodat de replicatie snel van de plaats van oorsprong naar het andere einde verloopt. RNA-primer wordt verwijderd en de opening wordt gevuld met complementaire nucleotiden door middel van DNA-polymerase I. Vanwege sequentiële opening van de DNA-dubbele keten en de replicatie ervan om twee ketens te vormen, wordt DNA-replicatie ook ritsduplicatie genoemd.

DNA-polymerase kan nucleotiden echter alleen in de richting 5 '-> 3' op de 3'-> 5'-streng polymeriseren, omdat deze aan het 3'-uiteinde wordt toegevoegd. Omdat de twee DNA-strengen in antiparallelle richtingen lopen, bieden de twee sjablonen verschillende uiteinden voor replicatie. Replicatie over de twee sjablonen verloopt dus in tegengestelde richtingen. Eén streng met polariteit У -> 5 'vormt continu zijn complementaire streng omdat 3'-uiteinde van de laatste altijd open is voor rek.

Het wordt leading strand genoemd. Replicatie is discontinu op de andere sjabloon met polariteit 5 '→ 3 omdat slechts een kort segment van de DNA-streng kan worden gebouwd in de richting 5' → 3 vanwege blootstelling van een klein stuk sjabloon in één keer. Korte segmenten van gerepliceerd DNA worden Okazaki-fragmenten genoemd (= Okasaki-segmenten; Reiji Okazaki, 1968). Elk van hen heeft 1000 - 2000 bp in prokaryoten en 100-200 bp in eukaryoten.

Een RNA-primer is ook vereist elke keer dat een nieuw Okazaki-fragment moet worden gebouwd. Na vervanging van RNA-primer door deoxyribonucleotiden en hun polymerisatie worden Okazaki-fragmenten samengevoegd door middel van enzym, DNA-ligase (Khorana, 1967). DNA-streng opgebouwd uit Okazaki-fragmenten wordt achterblijvende streng genoemd.

Aangezien een streng continu groeit terwijl de andere streng discontinu wordt gevormd, is de DNA-replicatie semi-discontinu. Aangezien replicatie bidirectioneel verloopt vanaf de oorsprong van replicatie of ori, vormt één ouderstreng een leidende streng aan de ene kant en een achterblijvende streng aan de andere kant. Het omgekeerde gebeurt op de ouderstrengen van de andere kant. Dit helpt bij het gelijktijdig voltooien van de replicatie in het gehele replicon.

7. Proeflezen en DNA-reparatie:

Een verkeerde basis wordt soms tijdens replicatie geïntroduceerd. De frequentie is één op de tienduizend. DNA-polymerase III kan hetzelfde waarnemen. Het gaat terug, verwijdert de verkeerde basis, maakt toevoeging van de juiste basis mogelijk en gaat vervolgens verder. Zelfs DNA-polymerase III is echter niet in staat om uracil te onderscheiden van thymine, zodat het vaak wordt opgenomen in plaats van thymine. Een dergelijke mismatching wordt gecorrigeerd door middel van een aantal enzymen.

Er is een afzonderlijk reparatiemechanisme voor schade aan het DNA als gevolg van mutatie, blootstelling aan UV-straling of verkeerde combinatie die ontsnapt aan het mechanisme voor het lezen van proeven. Een nick of break wordt veroorzaakt door een endonuclease nabij het herstelgebied. DNA-polymerase I (Komberg, 1969) verwijdert de niet-passende of verkeerde nucleotiden, indien aanwezig, en synthetiseert een correcte vervanging door de intacte streng als sjabloon te gebruiken. Het nieuw gevormde segment wordt afgesloten door DNA-ligase.